油菜蜂花粉总RNA（含小RNA）大量提取及RT-qPCR检测

陈璇吴人照王刚龙华晴戴关海任泽明童晔玲杨锋

（1浙江省中医药研究院基础实验研究所，310007；2浙江省中医药研究院中西医结合肿瘤研究所，310007）

油菜蜂花粉总RNA（含小RNA）大量提取及RT-qPCR检测

陈璇1吴人照1王刚2龙华晴1戴关海1任泽明1童晔玲1杨锋1

（1浙江省中医药研究院基础实验研究所，310007；2浙江省中医药研究院中西医结合肿瘤研究所，310007）

大量提取含小RNA的油菜蜂花粉总RNA，为研究油菜蜂花粉所含外源性miRNA在动物和人体内发挥的生理和病理功能研究奠定基础。改良苯酚-氯仿法大量提取油菜蜂花粉总RNA，Nanodrop 2000检测浓度和质量，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性；所得的总RNA经过RT-qPCR扩增。提取的总RNA260/280为2.11，产量高于1‰。电泳条带清晰，完整性良好。可扩增出油菜基因组中的miR-159和miR-166a，且可进行丰度差异比较。本方法能大量提取包括油菜蜂花粉在内的植物RNA（含小RNA），为中草药和其他植物来源天然产物中功能性miRNA在动物和人体内发挥的生物学功能研究奠定基础。

油菜蜂花粉；总RNA大量提取；miRNA；RT-qPCR

miRNA是一类22个核苷酸长度左右的非编码小RNA，通过碱基互补配对的方式在转录后水平调控基因的表达，从而参与几乎所有的生物学过程［1,2］，包括疾病过程［3］和营养调控［4］。2012年，南京大学张辰宇教授团队报道了一个有趣的现象，来自饮食的植物miRNA能跨界调控人类和其他哺乳动物的基因表达［5］。这项研究一经公布就受到生物学和生命科学领域研究人员的广泛重视，开始重复及拓展这一研究领域。这一领域的研究刚刚起步，而这类研究的开展，需要大量提取含有miRNA的植物总RNA，用于临床实验或动物实验，然而利用试剂盒从植物中大量提取含有miRNA的植物总RNA价格非常昂贵。

油菜蜂花粉是油菜花的雄性配子体，富含RNA（4‰）［6］，被广泛应用在食品、保健品和药品中，体内外试验证明花粉具有防治前列腺疾病、抗氧化、抗炎等功能［7-10］。本文以油菜蜂花粉为例，介绍一种从植物中大量提取含小RNA的总RNA方法，该方法基于苯酚-氯仿提取法［11］，并做了一些改进。

1　仪器与材料

1.1仪器

DL-6000B型冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；Centrifuge 5810R离心机（Eppendorf）；BSA124S电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；TD12001B电子分析天平（余姚市金诺天平仪器有限公司）；SYNERGY UV超纯水仪（德国Millipore公司）；DK-600S型三用恒温水箱（上海精宏实验设备有限公司）；basic 1磁力搅拌机（德国IKA公司）；分液漏斗；pH仪；研钵；容量瓶。

1.2材料

油菜蜂花粉，由安徽农业大学蜂业研究所提供，执行标准GB/T11758-89-蜂花粉，单一花粉率≥95%。

2　方法与结果

2.1试剂配制

2.1.1研磨缓冲液：0.18 M Tris；0.09 M LiCl；4.5 mM EDTA；1%SDS；用盐酸调节pH至8.2后定容。

2.1.2TLE溶液：0.2 M Tris；0.1 M LiCl；5 mM EDTA；用盐酸调节pH至8.2后定容。

2.1.3平衡苯酚：苯酚需要现平衡现用。先将苯酚预热至68℃，然后混合等体积的苯酚和TLE溶液，加入总体积1‰体积的15M NaOH，用磁力搅拌器混匀，转移至分液漏斗，静止分层后收集下层有机相，然后用等体积的TLE溶液再抽提两次。

2.2RNA提取

所有器皿和溶液按照《分子克隆》说明进行处理，另外，预冷研钵和研棒，提取步骤如下：①称取15 g油菜蜂花粉，研磨成粉后迅速转移至含有150 ml研磨缓冲液和50 ml TLE溶液平衡过的苯酚的烧杯中。②磁力搅拌器中速匀浆2 min后，加50 ml氯仿，磁力搅拌器混匀。③50℃温浴20 min。④离心，20 min，5000 rpm，4℃，然后转移上清于一新的离心瓶。加入50 ml TLE平衡过的苯酚，震荡混匀，然后加入50 ml氯仿，磁力搅拌器混匀。⑤转移剩余上清、中间层和下层于50 ml离心管，离心20 min，4000 rpm，4℃。转移上清合并到上一步骤中收集到的液体中。⑥离心15 min，5000 rpm，4℃，转移上清液于一新的离心瓶，加入50 ml TLE溶液平衡过的苯酚，磁力搅拌器混匀，然后加50 ml氯仿，磁力搅拌器混匀。抽提3次，直至中间层消失。⑦最后用氯仿抽提一次，离心后取上层水相，加入2倍体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜。⑧离心，30 min，5000 rpm，4℃，弃上清液。⑨75%乙醇漂洗沉淀2次，超净台中挥干酒精。⑩加入60 ml DEPC水。进行质量检测和电泳后，于-80℃保存备用。

2.3Nanodrop纯度和完整性检测

2.3.1Nanodrop质量检测：取1 μl RNA溶液，用Nanodrop 2000进行纯度检测，结果OD260和OD280的比值为2.1，说明本实验获得了高质量的RNA。

2.3.2琼脂糖凝胶电泳：对RNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，28sRNA的亮度约为18sRNA的两倍，说明RNA无降解，完整性好。

图1　油菜蜂花粉总RNA（1 μg）1%琼脂糖凝胶电泳图

2.4RT-qPCR检测miRNA

本实验采用两步法RT-qPCR。反转录利用Taq－ManmiRNA Reverse Transcription ki（tApplied Biosystems），15 μl体系含有80 ng的总RNA，3 μl的Taq－Man miRNA颈环引物（Applied Biosystems），按照试剂盒说明进行反转录，得到的cDNA作为PCR的模板。采用TaqManUniversal Master Mix II试剂在8联管中进行（TaKaRa），每个样品3个重复，10 μl的反应体系包含Taqman探针0.5 μl、Master mix 5 μl和模板4.5 μl，设一个水为模板的反应作为阴性对照，一个水作为空白对照，由于比较的两个micrRNA来自同一个样本，故未设内参基因，定量PCR在Applied Biosystems StepOnePlus荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）上进行。结果如图2所示，miR-159和miR-166a均得到了有效扩增，miR-166a（CT值：23.8±0.23）的丰度约为miR-159（CT值：31.22±0.33）的170倍。

3　讨论

传统观点认为，miRNA仅仅作为内源性miRNA在产生它们的个体内调控基因的表达。实际上，研究发现有些miRNA能超越个体之间的界限，作为外源性miRNA被输送到其他个体并调控后者的基因表达［12］，而食物含有的外源性植物miRNA能调控动物的生理和病理状况是其中一种有趣而重要的现象，而且食物来源的miRNA可能和维生素及矿物质等营养成分一样，有资格成为一种新的营养成分，并作为信息的载体调控哺乳动物基因的表达，从而维持和塑造动物的身体结构和功能。不仅如此，功能性食品和中草药中含有的miRNA可能发挥了重要的生理病理调控作用，有待我们去探索。

图2　miR-159和miR-166aqPCR扩增曲线

上述研究需要大量提取含miRNA的总RNA用以开展体内研究。用试剂盒从植物中大量提取含有miRNA的植物总RNA价格昂贵。本实验提供一种从油菜蜂花粉中大量提取含miRNA的总RNA的方法，操作步骤简单，获得的RNA经Nanodrop2000和电泳检测证明质量高，RT-qPCR能够检测到油菜蜂花粉miR-159和miR-166a的表达，且miR-166a的丰度约为miR-159的170倍。在本试验中，花粉总RNA的提取效率略高于1‰，这一结果低于王开发报道的油菜蜂花粉总RNA含量［6］，可能是由于获得RNA的纯度提高了，得率相对有所降低。此外，大量提取油菜蜂花粉时，可能研磨不够完全，可通过增加研磨时间和研磨力度提高总RNA得率。

本方法能用于大量提取包括油菜蜂花粉在内的植物RNA（含小RNA），为油菜花粉所含miRNA在动物和人体内发挥的生物学功能研究奠定基础。

［1］Bartel,D.P.MicroRNAs：Genomics,biogenesis,mechanism,and function［J］.Cell,2004,116：281-297.

［2］Ambros,V.The functions of animal microRNAs［J］.Nature, 2004,431：350-355.

［3］Garcia IA and Miska EA.MicroRNA functions in animal development and human disease［J］.Development,2005,132：4653-4662.

［4］Hoen ENMN,Rooij EV,Bushell M,et al.The role of microRNA in nutritional control［J］.Journal of Internal Medicine,2015,278：99-109.

［5］Zhang L,Hou D,Chen X,et al.Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1：evidence of cross-kingdom regulation by microRNA［J］.Cell Research,2011,22（1）：107-126.

［6］王开发,张玉兰,张盛隆.花粉中核酸的研究［J］.蜜蜂杂志, 1997,（7）：11-12.

［7］Pascoal A,Rodrigues S,Teixeira A,et al.Biological activities of commercial bee pollens：Antimicrobial,antimutagenic,antioxidant and anti-inflammatory［J］.Food and Chemical Toxicology,2014,63：233-239.

［8］陈璇,童晔玲,杨锋,等.花粉治疗前列腺增生及有效组分研究进展［J］.中国蜂业中旬刊（学术）,2013,64（1）：29-31.

［9］Wu YD and Lou YJ.A steroid fraction of chloroform extract from bee pollen of Brassica campestris induces apoptosis in human prostate cancer PC-3 cells［J］.Phytotherapy Research,2007,21（11）：1087-1091.

［10］Campos MG,Webby RF,Markham KR,et al.Age-induced diminution of free radical scavenging capacity in bee pollens and the contribution of constituent flavonoids［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51：742-745.

［11］John Wiley&Sons,Inc.Current Protocols in Molecular Biology［M］,1990.

［12］Sarkies P,Miska EA.Is There Social RNA［J］.Science,2013, 341（6145）：467-468.

Mass extraction of total RNA（containing small RNA）and RT-qPCR detection of rape（Brassica napus）bee pollen

Chen Xuan1，Wu Renzhao1，Wang Gang2,Long Huaqing1,Dai Guanhai1,Ren Zeming1,Tong Yeling1,Yang feng1
（1 Institute of Basic Medicine,Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310007,China；2 Institute of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine in Cancer Research,Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310007,China）

Total RNA that contain miRNAs were extracted from rape bee pollen,which laid a foundation to study the physiological and pathological functions of exogenous miRNAs of rape bee pollen in animals and human.Total RNA from mass rape bee pollen were extracted using a modified phenol-chloroform method,and the concentration and quality were determined by Nanodrop2000 as well as electrophoresis with 1%agarose gel.The total RNA was amplified by RT-qPCR.The ratios of A260/A280 of total RNA was 2.11,and the yield was over 1‰.The bands were clear on agarose gel and the integrity of RNA was good.Different abundance of miR-159 and miR-166a were amplified.The method can extract RNA（containing small RNA）from mass plant including rape bee pollen,which laid a foundation to study biological functions of functional miRNAs from herb and other natural products of plant origin in animals and human.

rape bee pollen；mass extraction of total RNA；miRNA；RT-qPCR

浙江省自然科学基金青年基金（LQ13C170002）；浙江省科技计划项目科技条件建设（2013F10001）

陈璇（1984-），女，助理研究员，博士。E-mail：chenxuan001564@163.com