香鱼成熟卵母细胞过熟进程中卵膜超微结构变化

徐玉敏， 苗 亮， 李明云， 安 钦， 李笑萌， 穆方申， 侯红红， 陈 炯

(宁波大学 教育部应用海洋生物重点实验室， 宁波 315211)



香鱼成熟卵母细胞过熟进程中卵膜超微结构变化

徐玉敏， 苗 亮， 李明云， 安 钦， 李笑萌， 穆方申， 侯红红， 陈 炯

(宁波大学 教育部应用海洋生物重点实验室， 宁波 315211)

香鱼成熟卵母细胞能较长时间维持受精能力，但随时间延迟受精能力逐渐降低直至消失。为探索其机制，采用透射电镜技术观察了香鱼卵母细胞过熟进程中卵膜超微结构的变化。结果显示：处于滤泡内时，成熟卵母细胞表面的放射膜(Zona radiate, ZR)分为3层，从外到内依次是放射外膜1(ZR1)、放射膜2(ZR2)、放射膜3(ZR3)，其中ZR1最厚；放射膜外有一层胶膜(Jelly coat, JC)。排出后的成熟卵母细胞放射膜ZR1消失，仅ZR2和ZR3两层，但放射膜外面的胶膜层依然存在，此时ZR2很薄，ZR3层次明暗分明，包含明暗相间的各5条带并且完全不透明，在与卵膜垂直的方向上形成亮区(Light region, LR)和暗区(Dark region, DR)。随着排卵后的时限延长，至48 h后，卵的胶膜层消失，放射膜压缩，内部出现孔道(Pore canals, PC)；60 h后胶膜层孔道数量增多，孔径变大；至96 h时孔道变长，贯穿ZR3的1/2；至104 h时ZR2基本解体，孔道继续伸长并贯穿ZR3，至此成熟卵母细胞彻底凋亡。

香鱼；卵母细胞；过熟；卵膜；透射电镜

AbstratThe mature oocytes of sweet fishPlecoglossusaltiveliscan maintain fertilization ability for a long time. In this study, we observed the ultrastructure′ changes ofP.altivelisoocytes during post-ovulatory process using transmission electron microscope(TEM). In follicular phase, the outer layer of oocyte memebrane is zona radiate(ZR), which includes three-layers(ZR1, ZR2 and ZR3 from outside to inside, and the thickest layer is ZR1). Outside of ZR is jelly coat(JC). After ovulation, ZR1 disappears and ZR remains two layers (ZR2 and ZR3), and JC still exisst. In this stage, ZR2 is very thin, and ZR3 includes 5 light-bands alternate with 5 dark-bands. ZR3 is completely opaque, and in the vertical of oolemma showed alternating "light region" and "dark region". At 48 h after ovulation, JC disappears, ZR is thinner and pore canals(PC) appears in ZR3. At 60 h, the number of PC increases and diameter enlarges. To 96 h, the length of PC increases to 1/2 of the ZR3. 104 h later, with the disintegration of ZR2, PC continues to elongate and pass through ZR3, and then the mature oocyte completely apoptosis.

香鱼(Plecoglossusaltivelis)是原产于东亚地区(中国、朝鲜半岛、日本)沿海通海江溪中的一种名贵一年生经济鱼类，俗名仙胎鱼、八月香、油香鱼、留香鱼等。香鱼肉质细嫩，清香味浓郁，色如黄金，有独特的风味和色泽。香鱼为裸卵鱼类，适当成熟卵母细胞直接排入到腹腔中，经生殖孔产出体外，附着于溪流沙砾上并在较为恶劣的环境中孵化，与其他鱼类的浮性卵和沉性卵相比，香鱼的卵膜较厚[1]。香鱼成熟的卵母细胞过熟进程较慢，经历96 h后仍能受精孵化，具有长时效的受精能力，其受精率与孵化率分别为10.83%和0.54%[2]，这种生命现象在鱼类中并不多见，这可能与香鱼的卵膜结构与过熟进程中的变化有一定关联。

鱼类的卵膜对卵细胞的生长、胚胎发育和繁殖具有重要作用，其卵膜超微结构在发育过程中的变化已经有了较多研究[3-5]。对于香鱼的研究，汤先念等[6]用扫描电镜技术观察香鱼成熟卵母细胞过熟进程中卵膜表面结构不断退化、解体，与过熟进程中的受精率逐渐降低存在相关性，但不清楚卵膜内部结构的情况。为了进一步了解卵母细胞过熟进程中卵膜的超微结构的变化，本研究在香鱼成熟卵母细胞膜表面结构在过熟进程中变化研究结果的基础上，通过投射电镜观察卵膜内部构造变化，研究结果可为研究香鱼卵子过熟进程的机理完善提供基础资料。

1　材料与方法

1.1实验材料

实验用鱼为人工养殖的10月龄性成熟香鱼，由浙江宁海凫溪清泉香鱼养殖专业合作社提供。挑选健康雌鱼，逐尾做好标记后暂养于塑料养殖箱中。从排卵开始取样，对同一条雌鱼进行连续挤卵采样，每次取样之间时间间隔12 h，直到鱼卵产尽。所取样品立即液氮速冻后转入-80℃超低温冰箱保存备用。

1.2透射电镜观察

采集样品后立刻用戊二醛进行固定，然后用常规方法制备电镜超薄切片[7]，用H-7650型透射电子显微镜(Hitch公司，日本)对超薄切片进行观察，对卵细胞内部结构特别是卵膜结构拍照。

2　结果

香鱼成熟卵母细胞过熟进程中卵膜超微结构的变化见图版Ⅰ。卵巢内即将排卵的卵细胞卵膜从外向内依次有鞘膜(T)、滤泡膜(FC)、放射膜(ZR，图版Ⅰ-1)。滤泡膜和放射膜之间为一层着色很浅、空隙较多的胶膜(JC)。放射膜由外向内分为放射膜1(ZR1)、放射膜2(ZR2)和放射膜3(ZR3)。3层中ZR1最厚、质地均一、不分层，并且内有长度和直径大小不一的孔道；ZR2最薄、电子密度最高，呈不连续的断层；ZR3与细胞质膜紧密相连、界限不易区分。

排出卵巢后的卵细胞(0 h)外面的胶膜层依然存在，但放射膜ZR1消失，仅ZR2和ZR3两层；ZR2很薄，电子密度低、着色较浅；ZR3加厚、层次分明，包含明暗条带各5条，并且明暗条纹往往在同一位置呈此薄彼厚的规律变化，从而在与卵膜垂直的方向上形成 “亮区(LR)”与“暗区(DR)”的明暗相间排列(图版Ⅰ-2)。排卵后12 h，卵细胞卵壳膜仍分为胶膜层和放射膜两层；ZR3靠近细胞质的一侧结构变得较宽、排列松散，而靠近ZR2的一侧则被压缩，并在“亮区”中出现零星的透明孔道(PC)；ZR2无明显变化，胶膜层开始退化、变的稀疏(图版Ⅰ-3)。排卵后24 h(图版Ⅰ-4)，卵细胞卵膜的胶膜层已不具备完整的膜结构，不连续地贴在ZR2外侧；ZR2电子密度降低、着色变浅；ZR3的条纹层次增多且开始压缩，“亮区”的宽度增大；另外，在ZR2的外侧相对于ZR3“暗区”的位置上出现了颗粒状的放射带突起(PZR)。

香鱼卵细胞排出后36 h，胶膜层仅剩零星残留；ZR2着色更浅，与胶膜层颜色基本相同，并在“亮区”位置有颗粒状突起；ZR3从内到外都有明显的压缩痕迹，亮纹和暗纹界限分明，“亮区”和“暗区”对比清晰(图版Ⅰ-5)。48 h时，胶膜层消失，ZR2着色更浅，在“暗区”位置仍有放射带突起(PZR)； ZR3的“暗区”中透明孔道数量增多、孔径扩大(图版Ⅰ-6)。60 h时，ZR3中的条纹从内到外结构紧密，透明孔道数量增多且孔径大小一致；ZR2上的颗粒状突起增大，边缘模糊，分散成细小的颗粒状(图版Ⅰ-7)。72 h时，卵细胞膜的ZR3外侧被压缩，内侧则较为松散，其中的透明孔道纵向延长，相互连接；ZR2内部出现空泡(图版Ⅰ-8)。

香鱼卵细胞排出后84 h，ZR3中透明孔道增多、增大，呈长矩形；ZR2外层结构模糊，呈细小颗粒状分布(图版Ⅰ-9)。96 h时卵细胞ZR2厚度减小、电子密度降低，边缘呈颗粒状；ZR3结构松散，层次模糊，其中的透明孔道的长度超过ZR3厚度的一半以上，贯穿多达6层暗条纹(整个ZR3有暗纹10层，图版Ⅰ-10)。至104 h时孔道逐渐延伸至ZR3和ZR2的交界处，并形成开口，卵细胞完全凋亡(图版Ⅰ-11)。

图版Ⅰ香鱼卵细胞膜超微结构的透射电镜观察PlateⅠ Membrane configuration of ayu oocyte obserwed by Transmission electron microscope (TEM)

1：排卵前 (×15 000)；2:排卵后0 h(×25 000)；3:排卵后12 h(×25 000)；4:排卵后24 h(×25 000)；5:排卵后36 h(×15 000)；6:排卵后48 h(×15 000)；7:排卵后60 h(×12 000)；8:排卵后72 h(×20 000)；9:排卵后84 h(×15 000)；10:排卵后96 h(×20 000)；11:排卵后104 h(×12 000)。DR：暗区；DS：暗带；LR：亮区；LS：亮带；MV：卵细胞微绒毛；PC：放射带孔道；PF：滤泡层突起；PZR：放射带突起；ZR1：放射带1；ZR2：放射带2；ZR3：放射带3

3　讨论

魏刚等[8]对鲶鱼以及其他硬骨鱼[9]的研究中发现，鲶鱼卵母细胞放射膜从外到内分为ZR1、ZR2、ZR3 3层，ZR1与滤泡细胞相连；ZR2较薄，电子染色深，由不定型物质组成；ZR3最里面，在卵细胞成熟过程中大幅增厚，且在卵细胞成熟(即排卵)后，ZR1消失。香鱼的卵母细胞在成熟前后同样出现这种现象，卵细胞在排卵前后，放射膜的组成发生了变化，卵巢中的成熟卵细胞在排卵前由3层结构组成，从外到内依次是ZR1、ZR2、ZR3，初期ZR1的厚度占整个放射膜的大部分，但到最终排卵时，ZR1消失；ZR2电子密度显著增大，厚度也有所增加；ZR3的厚度明显增厚，由原来的0.2～0.5μm增厚到5μm。香鱼卵细胞放射膜包含3层结构，国外很多研究都有相似的结果[10-14]。

Anderson[13]的研究发现海马和尖嘴鱼的放射膜ZR3在卵细胞成熟过程中厚度和密度都有增加，最后变成完全闭塞的结构，且呈现明暗相交的分层现象。香鱼卵细胞放射膜中也分布有中空的孔道，卵母细胞伸出的微绒毛(Microvilli from the oocyte, MV)和滤泡细胞突起(Protrusions of follicular cells, PF)在这些孔道中延伸，放射膜的超微结构也有变化。卵细胞ZR3从含有很多微孔孔道的网状变成了完全密实不透明的膜结构，而且ZR3结构同样呈现出明暗相交的片层状，在结构变化上与上述现象相同。Dumont[15]认为压缩的丝状放射膜具有阻止卵细胞在低水位环境里失水的作用，这对于产黏性卵和沉性卵鱼类的胚胎孵化具有重要意义。香鱼卵细胞膜的ZR3从网格状到一体闭合型的改变或许可以使卵细胞在一定程度上成为一个相对独立于外界环境的封闭整体，根据Niksirat[16]对鳌虾的研究也发现了卵的封闭结构，推测这种状态能够通过其他路径限制或者减弱了卵细胞内的代谢活动以及与外界环境的物质能量交换，从而可以促进香鱼卵细胞在排出卵巢后保持较长时间的受精能力和较高的孵化率。

关于卵细胞排出卵巢后的结构变化未见报道。本研究发现香鱼成熟的卵细胞排出卵巢后，过熟进程启动，在放射膜的外面包裹着一层胶膜至 48 h后消失，使卵子质量急剧下降。ZR2是放射膜的外层结构，在过熟过程中ZR2的电子密度逐渐降低，在“亮区”所对应的位置，ZR2出现了颗粒状的突起，这些突起的内部在72 h出现空泡，其外层的胶膜消失后，从第48小时起，ZR2的外缘开始变得模糊，并最终消失，致使胞外物质可渗入胞内。ZR3是由数层明暗相间的条纹状物质组成，其层次和密度变化无规律，在卵子保存的前36 h，ZR3条纹层数由开始的5层增加到9层；前60 h内，ZR3结构从内而外逐步压缩，但从72 h起，ZR3的内层又开始变松。由于压缩程度不同，组成ZR3的这些条纹相互之间厚度不一，同一条纹对应在卵膜不同的位置厚薄也有差异，且呈现规律性的变化，从而形成了结构鲜明的“亮区”和“暗区”。在“亮区”所在区域，从48 h开始出现透明的孔道，这些孔道长度逐渐增大，最后形成贯穿ZR3的孔道，随着ZR2的最终消失，这些孔道出现在卵细胞表面。推测外层胶膜的消失，放射膜组成和致密性的改变，膜内透明孔道的形成，以及扩大可能会对卵细胞跟外界环境的物质交流产生影响，从而使得卵细胞的质量下降。至于为什么ZR1和ZR2分别在卵细胞的成熟和过熟过程中消失，有待于今后进一步研究。

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Changes of egg envelope of sweet fish Plecoglossus altivelis during post-ovulatory ageing

XU Yu-min, MIAO Liang, LI Ming-yun, AN Qin, LI Xiao-meng,MU Fang-shen, HOU Hong-hong, CHEN Jiong

(Applied Marine Biotechnology Key Laboratory of the Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Plecoglossusaltivelis; maturatonal oocyte; post-ovulatory ageing; egg envelope; TEM

2015-12-04；

2016-01-06

国家自然科学基金项目(41406154)；浙江省“十二五”水产育种专项(2012C12907-9)；长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0734号)；浙江省“水产”重中之重学科开放基金项目(xkzsc1514)；浙江省教育厅(理)/科研计划项目(Y201430860)；宁波市自然科学基金项目(2015A610271)

徐玉敏，硕士研究生，研究方向为鱼类遗传育种与增养殖，E-mail: xuyumin90@163.com

李明云，教授，博士生导师，研究方向为鱼类增养殖、遗传育种和种质资源保护，E-mail: limingyun@nbu.edu.cn

Q954;S917.4

A

2095-1736(2016)05-0005-03

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.005