顺德地区香港海鸥型菌流行情况与耐药性规律研究

冯雪仪 梁瑞莲 梁玉全 叶珮玑 郑嘉文

顺德地区香港海鸥型菌流行情况与耐药性规律研究

冯雪仪 梁瑞莲 梁玉全 叶珮玑 郑嘉文

广东省佛山市顺德区第一人民医院（佛山528300）

目的 对从淡水养殖鱼类、青蛙样品以及腹泻病人大便样品分离的菌株作临床常用抗生素的耐药性分析，为相关疾病的治疗提供实验依据。方法 获取临床腹泻病人的新鲜大便标本和在水产品市场采集淡水鱼和青蛙样品取肠道内含物分别涂布选择性培养基，选取疑似菌落进行生化鉴定和16S rRNA基因分子鉴定，确证为香港海鸥型菌的菌株采用纸片扩散法测定分离株对几类临床常见抗菌药物的敏感性。结果 本次检测的24株香港海鸥型菌分离株对八种常用的抗生素药物表现不同程度的耐药性。蛙源株对环丙沙星、阿米卡星、头孢他啶的耐药率高于鱼源株。其中分离的11株分离株（45.8%）对3个种类及以上抗生素表现耐药，为多重耐药株。结论 抗生素作为促生长剂和动物疾病防治被广泛加于动物饲料中，可能导致食源性细菌耐药性增加。人们有可能通过摄入含有香港海鸥型多重耐药株污染的食物而获得抗生素耐药性的潜在危险。

海鸥型菌 流行情况 常用抗生素 耐药性规律

香港海鸥型菌（Laribacter hongkongensis）隶属奈瑟菌科的革兰阴性杆菌。该菌于2001年首次在一名香港肝硬化病人的胸腔脓液中分离得到，随后通过生化与分子鉴定确定其为新细菌属，并根据其首次发现地和海鸥状的形态而命名［1］。在2004年的一个多中心病例对照实验中，香港大学的医学研究人员发现香港海鸥型菌与社区获得性胃肠炎和急性腹泻有显著关联，且其致病性与食用淡水鱼和外出旅游密切相关［2］。

至今，该菌已在亚洲、欧洲、非洲和美洲的病人身上分离得到，我国则在香港、浙江和广东先后报导感染案例［3-4］，表明该菌的地区分布和致病力具有全球性。流行病学调查进一步发现，香港海鸥型菌可从淡水鱼类和青蛙的肠道中分离得到，推测该菌引致肠胃炎和腹泻可能是由于病人食用了被污染的淡水鱼或青蛙［5-6］。另外，最近的报道指出该菌可在自然淡水环境中分离得到，饮用不洁净的水源亦有可能是该菌传播途径中的一种［7］。上述研究证据表明，香港海鸥型菌是一种有重要临床与环境意义的新型病原菌。

多个研究报导指出，香港海鸥型菌对抗菌药物的耐药性比较严重。在一项针对不同来源香港海鸥型菌菌株的药敏试验显示，14株香港海鸥型菌菌株对24种常用抗菌药物中的15种分别表示出耐药性［8］。在总结了香港海鸥型菌中的耐药规律后，香港海鸥型菌的发现者Woo等建议以喹诺酮类抗生素作为需要抗菌治疗的香港海鸥型菌感染病人首选药物［9］。然而，喹诺酮耐药的菌株也在2009年发现。因此，开展对香港海鸥型菌的耐药性机制及流行规律的研究，指导临床抗菌治疗，是很有必要的。

1 资料与方法

1.1 一般资料 在2015年2月—2016年1月期间，顺德第一人民医院课题组成员取200份临床腹泻病人的新鲜大便标本，同时在水产品市场采集103份淡水鱼和97份青蛙样品取肠道内含物标本，共分离出22株香港海鸥型菌，其中鱼类分离株13株，食用蛙分离株9株，腹泻病人分离株0株。香港海鸥型菌病人分离株HKU1和鱼分离株ZSU1由广州医学院医学检验系实验室馈赠。

1.2 方法

1.2.1 标本培养 病人大便标本及淡水鱼、青蛙肠道内容物用棉拭子直接涂布接种于麦康凯琼脂培养基平板，置37℃恒温箱培养48h。挑取浅灰色、半透明圆形、略凸起、直径在1.0～1.5 mm之间的光滑菌落接种营养琼脂平板分纯，置37℃恒温箱培养24 h。

1.2.2 生化鉴定 根据LH的主要生化特性，选定生化试验项。将单个可疑菌落穿刺接种尿素琼脂和三糖铁琼脂，进行氧化酶、触酶、精氨酸双水解酶试验。以大肠杆菌ATCC25922作为阴性对照。

1.2.3 PCR鉴定 用水煮法提取所有LH可疑菌株的DNA。挑取若干个纯菌落于200μl无菌蒸馏水，振荡混匀，100℃水浴10 min，冰浴2 min，12000 r/min，离心5 min，取上清作为模板。针对LH的16 S rRNA基因序列自行设计的引物，上游序列为：5′ATC CCTAAG GCT AAT ACC CT 3′，下游序列为：5′AATCTC TTCGAG GTTCGG TA 3′，扩增片段大小为550 bp。使用50μl反应体系，包括10× PCR缓冲液5μl，25 mmol/L MgCl224μl，2.5 mmol/L dNTPs 4μl，5 U/μl的Taq DNA聚合酶0.25μl，0.6 mmol/ L的引物各1μl，模板DNA 5μl，双蒸水29.75μl。反应条件为94.0℃5min，94.0℃30 s，53.0℃40 s，72.0℃40 s，35个循环，72.0℃5 min。用DL2000作为PCR扩增产物的marker，并以LH鱼源株ZSU1为阳性对照。

1.2.4 耐药性测定 采用K-B纸片扩散法测定，用金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC 25922作质控菌株，判定标准按照美国临床与实验室（CLSI）执行。抗生素纸片包括：氨苄西林、氨苄西林/苏巴坦、头孢他啶、安曲南、环丙沙星、阿米卡星、庆大霉素和美罗培南。

1.3 统计学方法 此次临床研究数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料以（%）表示，组间数据比较采取χ2检验，而率的检验采取Fisher的概率检验法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

24株香港海鸥型菌分离株的耐药性分析（见表1）。耐药率从高到低依次如下：氨苄西林（100%），头孢他啶（75%），环丙沙星（50%），阿米卡星（20.8%），庆大霉素（8.3%），而氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、美罗培南耐药率为0。

不同来源香港海鸥型菌分离株的耐药性比较（见表2）。应用卡方检验，按照α=0.05水准，蛙源株对环丙沙星、阿米卡星、头孢他啶的耐药率高于鱼源株，而庆大霉素fisher=0.526、P＞0.05，差异无统计学意义。

表1 24株香港海鸥型菌分离株的耐药率例（%）

表2 鱼源株和蛙源株对各种抗生素耐药性卡方分析%

3 讨 论

香港海鸥型菌的宿主已经证实主要为淡水鱼类与蛙类，有研究者推测香港海鸥型菌引起人群腹泻的途径是通过食入未经煮熟的水产品或在加工过程中交叉污染食物而引起的感染，临床表现为水样腹泻，部分患者有血便。其可能的源头、传播途径、造成人类的可能感染方式和高危因素以及如何进行有效的疾病预防和控制等多方面的的问题都亟待解决。

目前，发展中国家抗生素滥用情况十分普遍。抗生素作为促生长剂和动物疾病防治被广泛加于动物饲料中，在抗生素选择的压力下，可能导致食源性细菌耐药性增加。如此广泛的耐药率，不排除与农业、水产养殖业不规则使用抗生素有关，人们有可能通过摄入含有香港海鸥型多重耐药株污染的食物而获得抗生素耐药性的潜在危险。本次检测的24株香港海鸥型菌分离株对八种常用的抗生素药物表现不同程度的耐药性。蛙源株对环丙沙星、阿米卡星、头孢他啶的耐药率高于鱼源株。其中分离的11株分离株（45.8%）对3个种类及以上抗生素表现耐药，为多重耐药株。

顺德地区淡水鱼养殖与贸易有悠久的历史，淡水鱼是绝大部分顺德人口的日常菜肴，食用鱼生（生淡水鱼片）是有顺德特色的饮食习惯。然而，未经煮熟的鱼肉极易携带肠道疾病相关的病原菌，每年都有很多食用生鱼片后的胃肠炎病例。香港海鸥型菌寄居在淡水鱼肠道中，如制作鱼类食品尤其是生鱼片时发生肠道内容物污染，该菌很可能随食物进入人体，引起相关感染疾病。

在流行病学调查中，常规的血清学鉴定往往重复性低、操作复杂和费时等，延误疫情的控制，而分子生物学技术为细菌的基因分型提供了有效手段，可以快速鉴定病原菌的种属。本实验对环境和临床标本中的香港海鸥型菌进行分离鉴定，调查该菌在养殖鱼类、蛙类和腹泻病人中的分布，揭示该菌在顺德地区的流行规律，并进一步对分离菌株作临床常用抗生素的耐药性分析，测定了香港海鸥型菌分离株对抗生素的敏感性，为香港海鸥型菌食源性疾病的预防和控制、流行病学调查和溯源提供了研究依据，香港海鸥型菌的耐药表型与基因分型之间的关系仍有待进一步的研究。

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10.3969/j.issn.1000-8535.2016.04.025

2016-03-09）

2015年佛山市医学科研基金立项（2015112）