高效液相色谱法测定止咳化痰颗粒中苦杏仁苷含量

刘彬果，张楠

（中国人民解放军第二五四医院，天津300142）

高效液相色谱法测定止咳化痰颗粒中苦杏仁苷含量

刘彬果，张楠

（中国人民解放军第二五四医院，天津300142）

目的建立测定止咳化痰颗粒中苦杏仁苷含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法色谱柱采用ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相为甲醇-0.1%磷酸（30∶70），流速1.0 mL/min，柱温室温，检测波长210 nm。结果苦杏仁苷进样量在0.4～4.0 g（r=0.999 7）范围内与峰面积积分值线性关系良好，平均加样回收率为101.38%，RSD为1.90%（n=6）。结论该法快速、简便、准确、重复性好，结果可靠，可用于止咳化痰颗粒中苦杏仁苷的含量测定，可全面控制止咳化痰颗粒的质量。

止咳化痰颗粒；苦杏仁苷；高效液相色谱法；含量测定

止咳化痰颗粒为中国人民解放军第二五四医院的临床经验方，是由瓜蒌、前胡、苦杏仁、白茅根等8味药材组方的复方制剂，具有止咳化痰的功效，适用于急、慢性支气管炎，咳嗽多痰。方中苦杏仁味苦性温，宣肺下气，止咳平喘，为方中主药药味之一［1-2］。苦杏仁苷是苦杏仁中的有效成分，关于其含量测定方法已有相关报道［3-4］，该制剂现有质量标准中仅有中药定性鉴别的方法，而无主要药味的含量测定方法。为了更好地控制止咳化痰颗粒的质量，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法对方中苦杏仁的指标成分苦杏仁苷进行定量研究和方法学验证试验，以建立控制止咳化痰颗粒的质量标准。现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），OpenLAB CDS色谱工作站。

1.2试药

苦杏仁苷对照品（批号为120821-201212）购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；止咳化痰颗粒由本院制剂室提供。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：ZORBAXSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（30∶70）；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；检测波长：210 nm，进样量：10 μL。理论板数按苦杏仁苷峰计算不低于3 000。

2.2溶液制备

对照品溶液：精密称取苦杏仁苷对照品10.22 mg（纯度为98.0%），置25 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1 mL含0.400 6 mg的对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液10 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含0.080 1 mg的对照品溶液。

供试品溶液：取止咳化痰颗粒，研细，取约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按处方组成的比例，制备不含苦杏仁药材的阴性样品。按供试品溶液制备方法，制备不含苦杏仁药材的阴性对照品溶液。

2.3方法学考察

专属性试验：分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样，记录色谱图。结果见图1。可见，供试品溶液和对照品溶液色谱具有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照品溶液却无此色谱峰，表明样品中的其他成分对苦杏仁苷的测定无干扰。

图1　高效液相色谱图

线性关系考察：分别吸取对照品溶液1，2，4，5，6，8，10 μL，依次进样，测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程Y=963.13 X+4.674 8，r=0.999 7（n=7）。结果表明，苦杏仁苷进样量在0.4～4.0 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。见表1。

表1　苦杏仁苷线性试验结果（n=7）

精密度试验：精密吸取苦杏仁苷的同一对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图峰面积。结果峰面积值分别为756.0，757.4，755.7，755.1，754.7，754.6，RSD为1.0%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批供试品（批号为14490137）溶液，分别于0，1，2，3，4，5，9，12，24 h时测定。结果峰面积的RSD为3.95%（n=9），表明供试品溶液在24 h内稳定。见表2。

表2　苦杏仁苷稳定性试验结果（n=9）

重复性试验：取同一批样品（批号为14490137）6份，按供试品溶液制备方法项下制备溶液，依法测定，记录色谱图。结果苦杏仁苷的平均含量为1.93 mg/g，RSD为0.90%（n=6），表明方法重复性良好。见表3。

表3　苦杏仁苷重复性试验结果（n=6）

加样回收试验：称取已知含量的样品（批号为14260115）约0.3 g，精密称定6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入苦杏仁苷对照品溶液（质量浓度为0.400 6 g/L）各2.0 mL，精密加入甲醇10 mL，称定重量，甲醇超声提取40 min，（功率250 W，频率40 kHz）。放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液即得。依拟订色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率。结果见表4。

2.4样品含量测定

取样品（批号为14260115，14490137，15160115）按供试品溶液制备方法项下制备，依法测定，记录色谱图。结果见表5。

3　讨论

3.1指标成分选择

止咳化痰颗粒为临床应用多年，疗效确切，其方中药材品种较多，化学成分复杂。苦杏仁性温，宣肺下气，止咳平喘［1，10］，为方中主药之一。苦杏仁苷是苦杏仁的主要活性成分，含量较高，性质稳定，但口服在酶的作用下，分解会生成苯甲醛和氢氰酸，而氢氰酸大量摄入会出现中毒［5-6］。为了有效控制制剂质量，确保临床用药的安全有效，本试验中采用HPLC法，选取苦杏仁苷为指标成分，测定止咳化痰颗粒的含量。

表4　苦杏仁苷加样回收试验结果（n=6）

表5　3批样品中苦杏仁苷含量测定结果（mg/g）

3.2测定波长选择

参考药典［10］和文献［7-8］，对止咳化痰颗粒中苦杏仁苷的含量测定色谱条件进行了考察。经过对苦杏仁苷对照品溶液的紫外光谱扫描，发现其在210 nm波长处有较好的吸收，故选择210 nm为检测波长。

3.3提取条件选择

采用甲醇超声提取和加热回流提取的方法进行比较，结果显示，两种提取方法含量相近。由于超声提取方法简单，便于操作，因而采用超声提取的方法。同时，对提取时间30 min，40 min进行比较，随着超声时间时间延长，含量会加大。经试验超声提取40 min，可达到提取完全的目的，故选用超声提取40 min。

3.4流动相选择

参考药典［10］及文献［7-9］，曾考察不同流动相，分别为乙腈-0.1%磷酸溶液（9∶91）、甲醇-0.1%磷酸溶液（30∶70）和甲醇-水（20∶80）。结果显示，流动相为甲醇-0.1%磷酸（30∶70）、流速为1 mL/min、检测波长为210 nm时，苦杏仁苷峰达到很好分离，峰形较好。

综上所述，本方法操作简单，结果准确，重复性好，空白无干扰，可作为止咳化痰颗粒质量标准中含量测定的方法。

［1］游洁.杏仁的研究概况［J］.中国医药指南，2014，12（33）：57-58.

［2］许宁侠.苦杏仁苷的研究进展［J］.内蒙古中医药，2012，31（9）：66-67.

［3］苟小军，黄强.HPLC法测定哮喘颗粒中苦杏仁苷的含量［J］.实用药物与临床，2014，17（12）：1 594-1 595.

［4］蒋玉芳，陈宗良，吴立成.HPLC法测定前列安通胶囊中苦杏仁苷的含量［J］.中华中医药学刊，2013，31（1）：215-216.

［5］常军.HPLC法检测苦杏仁苷及其酶解产物［J］.天然产物研究与开发，2013，12（25）：1 085-1 088.

［6］周政政，郭永辉.苦杏仁苷纯度标准物质研制和纯度标准值及不确定度分析方法研究［J］.医药导报，2014，32（4）：504-510.

［7］王倩.HPLC法测定小儿肺热咳喘口服液中苦杏仁苷的含量［J］.临床合理用药，2015，8（8）：37-39.

［8］王鼎峰，胡冰.HPLC法测定宫瘤清片中苦杏仁苷、黄芩苷的含量［J］.海峡药学，2014，26（5）：40-43.

［9］李月亭，陈凌云，魏丹霞，等.HPLC法测定清热润燥口服液中苦杏仁苷的含量［J］.中国医药科学，2015，12（5）：69-71.

［10］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：201-202.

Content Determination of Amygdalin in Zhike Huatan Granules by HPLC

Liu Binguo，Zhang Nan
（PLA No.254 Hospital，Tianjin，China300142）

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of the amygdalin content in Zhike Huatan Granules.Methods Amygdalin was determined by HPLC with ZORBAX SB-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The mobile phrase was composed of methanol-1%phosphoric acid water（30∶70），the flow rate was 1 mL/min and detection wave length was 210 nm and the column temperature was room temperature.ResultsThe linear range of amygdalin was 0.4-4.0 μg（r=0.999 7）.The average recovery was 101.38%，RSD 1.90%（n=6）.ConclusionThis method is fast，simple，accurate，well reproducible，and reliable，which is suitable for the content determination of amygdalin in Zhike Huatan Granules and its quality control.

Zhike Huatan Granules；amygdalin；HPLC；content determination

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2016）15-0068-03

中国人民解放军总后勤部专项课题，项目编号：14ZJZ01。

刘彬果，博士研究生，主管药师，研究方向为药物分析学，（电子信箱）lbg991227@163.com。

（2016-02-20；

2016-04-08）