程序性死亡分子1及其配体1在尖锐湿疣患者外周血T淋巴细胞的表达及意义

陈惠勇 杨文林 林立 黄新宇 尹嘉文 陈嘉惠

510260广州医科大学附属第二医院皮肤科

程序性死亡分子1及其配体1在尖锐湿疣患者外周血T淋巴细胞的表达及意义

陈惠勇 杨文林 林立 黄新宇 尹嘉文 陈嘉惠

510260广州医科大学附属第二医院皮肤科

目的研究程序性死亡分子1（PD⁃1）及其配体1（PD⁃L1）在尖锐湿疣患者外周血T淋巴细胞表面的表达，探讨PD⁃1/PD⁃L1信号通路在尖锐湿疣患者细胞免疫中的作用。方法采用流式细胞仪检测30例尖锐湿疣患者和20例健康对照者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1的表达及CD4+、CD8+T淋巴细胞计数，采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法检测血清中白细胞介素2（IL⁃2），干扰素γ（IFN⁃γ）的水平，比较两组间的差异，分析尖锐湿疣患者外周血T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1表达水平与CD4+、CD8+T淋巴细胞计数、细胞因子IL⁃2、IFN⁃γ的相关性。结果尖锐湿疣组CD4+、CD8+T淋巴细胞PD⁃1表达水平（分别为9.48%±3.31%和12.52%±3.17%）、PD⁃L1表达水平（4.40%±1.46%、7.07%±2.23%）分别高于健康对照组（PD⁃1：7.12%±2.16%、9.95% ± 2.17%，t=2.81、3.16，均P＜ 0.01；PD⁃L1：3.26% ± 1.13%、5.39% ± 1.69%，t=2.96、2.88，均P＜ 0.01）。尖锐湿疣组CD4+T淋巴细胞计数（727.43± 138.59个/μl）低于对照组（804.25± 92.83个/μl，t=2.17，P＜ 0.05），CD8+T淋巴细胞计数与对照组差异无统计学意义（t=1.24，P＞0.05），CD4+/CD8+比值（1.23±0.35）低于对照组（1.46± 0.34，t=2.24，P＜ 0.05）。尖锐湿疣组血清IL⁃2、IFN⁃γ水平均低于对照组（t=2.12、2.16，均P＜ 0.05）。相关分析显示，尖锐湿疣患者外周血CD4+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1表达水平分别与CD4+T淋巴细胞计数、CD4+/CD8+比值、IL⁃2、IFN⁃γ水平均呈负相关（P＜ 0.05）；CD8+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1表达水平与CD4+/CD8+比值均呈负相关（P＜0.05），与CD8+T淋巴细胞计数无相关性（P＞0.05）。结论尖锐湿疣患者外周血T淋巴细胞高表达的PD⁃1可能通过与其配体PD⁃L1作用形成PD⁃1/PD⁃L1信号通路，抑制T淋巴细胞免疫应答，导致尖锐湿疣患者CD4+T淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值下降，IL⁃2、IFN⁃γ减少。

尖锐湿疣；T淋巴细胞；程序性死亡分子1；程序性死亡分子配体1

约90%的尖锐湿疣患者为人类乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）低危型（6、11型）感染引起［1］。HPV可通过影响抗原提呈细胞的黏附和迁移，改变细胞因子、趋化因子表达等复杂的机制［2］，发生逃逸现象，逃避宿主免疫系统的攻击，致使病毒持续感染，反复发作。尖锐湿疣的特异性免疫主要是细胞免疫，其中T淋巴细胞为主要的效应细胞［3］。近年来，主要表达于活化的T淋巴细胞表面的负性共刺激信号分子陆续被发现，如程序性死亡分子1（programmed death⁃1，PD⁃1）和程序性死亡分子配体1（programmed death ligand⁃1，PD⁃L1）。研究显示，PD⁃1/PD⁃L1信号通路可通过限制T细胞的激活和扩散，减少细胞因子的产生或扩散等，抑制效应T淋巴细胞的免疫表达［4］，引起T淋巴细胞功能减弱、无能甚至死亡［5］。本研究通过分析尖锐湿疣患者外周血T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1表达水平与CD4+、CD8+T淋巴细胞计数、白细胞介素2（interleukin⁃2，IL⁃2）、干扰素γ（interferon⁃γ，IFN⁃γ）水平的相关性，探讨PD⁃1/PD⁃L1信号通路在尖锐湿疣患者细胞免疫中的作用。

对象与方法

1.研究对象：2015年9-12月在我院皮肤科诊断为尖锐湿疣的30例患者纳入尖锐湿疣组。纳入标准：符合卫计委疾病控制司制定的尖锐湿疣诊断标准。排除标准：合并HIV感染等其他性病；合并自身免疫性疾病和其他过敏性疾病；合并脑、肺、心、肝、肾、血液等系统性疾病；合并乙肝等其他病毒感染性疾病；合并结核、肿瘤等疾病；1年内使用过免疫增强剂或免疫抑制剂；月经期、妊娠期、哺乳期妇女。来自我院体检中心的健康者20例为对照组。所有研究对象均了解检查项目并签署知情同意书。

2.仪器和试剂：Navios流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），全自动酶标仪ELX800（美国BioTek公司）。流式细胞术抗体：藻红蛋白⁃花青苷5标记的CD3抗体（CD3⁃PC5）、异硫氰酸荧光素标记的CD4抗体（CD4⁃FITC）、藻红蛋白⁃得克萨斯红标记的CD8抗体（CD8⁃ECD）（美国Beckman Coulter公司），PE标记的鼠抗人PD⁃1（PD⁃1⁃PE）、PD⁃L1（PD⁃L1⁃PE）抗体及各种同型对照IgG抗体（美国eBioscience公司）。人IL⁃2、IFN⁃γ ELISA试剂盒（中国杭州联科生物技术股份有限公司）。

3.标本收集及处理：所有研究对象均抽取6 ml静脉血，其中2 ml于肝素锂抗凝管常温保存，在6 h内用流式细胞仪检测CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1表达水平；2 ml于EDTA⁃K2抗凝管中常温保存，在6 h内进行CD4+、CD8+T淋巴细胞流式细胞计数；余2 ml于干燥管在室温下静置1 h后离心（1 260×g，5 min），取上层血清置1 ml微量离心管中标号，-80℃冰箱保存备用。

4.T淋巴细胞表面PD⁃1及PD⁃L1的检测：取3支流式细胞分析管，其中1支加入荧光素标记单抗CD3⁃PC5、CD4⁃FITC、CD8⁃ECD和PD⁃1⁃PE各5 μl，1支加入CD3⁃PC5、CD4⁃FITC、CD8⁃ECD和PD⁃L1⁃PE各5 μl，另1支中加入相应同型对照IgG⁃PE抗体。3支试管中各加肝素锂抗凝血50 μl，室温避光孵育15 min，加入经10倍稀释的溶血素C 200 μl，静置15 min后，加入2 ml磷酸盐缓冲液（PBS），离心（310×g，5 min），弃上清，加500 μl PBS重悬后流式细胞仪检测。

5.外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞计数测定：取2支流式细胞分析管，其中1支加入荧光素标记单抗CD3⁃PC5、CD4⁃FITC、CD8⁃ECD各5 μl，另1支加入相应同型对照IgG抗体。在2支试管中各加入EDTA⁃K2抗凝血50 μl，室温避光孵育15 min，加入经10倍稀释的溶血素C 200 μl，静置15 min后，加入2 ml PBS，离心（310 ×g，5 min），弃上清，加500 μl PBS重悬，再加相应比例的荧光计数微球后，流式细胞仪检测。

6.细胞因子IL⁃2、IFN⁃γ水平的检测：采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中细胞因子IL⁃2、IFN⁃γ水平，严格按照ELISA检测试剂盒说明书操作。

7.统计学处理：采用SPSS 22.0软件，计量数据符合正态分布以x±s表示，组间比较采用两独立样本t检验；相关性分析采用Pearson相关分析；P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

1.一般情况：30例尖锐湿疣患者，男17例，女13例，年龄18～60（36.48±10.71）岁；20例对照者，男12例，女8例，年龄18～60（37.65± 10.14）岁。两组在性别、年龄上的差异均无统计学意义，具有可比性。尖锐湿疣患者病程（2.16±0.48）个月。

2.外周血T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1的表达水平：尖锐湿疣患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1的表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

3.外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞计数、CD4+/CD8+比值、IL⁃2水平、IFN⁃γ水平：尖锐湿疣组CD4+T淋巴细胞计数、CD4+/CD8+比值、IL⁃2和IFN⁃γ水平均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），而其CD8+T淋巴细胞计数与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

4.相关分析：Pearson相关分析显示，尖锐湿疣患者外周血CD4+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1表达水平分别与CD4+T淋巴细胞计数（r=-0.415、-0.450）、CD4+/CD8+比值（r=-0.407、-0.382）、IL⁃2（r=-0.393、-0.426）、IFN⁃γ水平（r=-0.412、-0.392）呈负相关（均P＜ 0.05）；CD8+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1的表达水平与CD4+/CD8+比值均呈负相关（r=-0.424、-0.455，均P＜0.05），而与CD8+T淋巴细胞计数无明显相关性（r=0.272、0.166，均P＞0.05）。

表1 尖锐湿疣患者CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD⁃1及PD⁃L1表达水平（%，x±s）

讨 论

尖锐湿疣由HPV感染所引起，HPV持续感染的关键环节是免疫逃逸导致的病毒清除障碍［6］，而HPV感染免疫逃逸机制可能与T淋巴细胞为主的细胞免疫功能障碍密切相关。T细胞活化不仅需要主要组织相容性复合体（MHC）分子将抗原肽递呈给抗原特异性T细胞提供第一信号，还需要一些细胞表面共刺激分子（如CD28及B7等）传递协同刺激信号（第二信号）［7］，而PD⁃1和PD⁃L1则分别为CD28及B7的家族成员。PD⁃1主要表达于活化CD4+、CD8+T细胞上，在调节T细胞活化和耐受方面发挥关键性作用。PD⁃L1主要表达于T细胞、B细胞上，并已被证实在免疫耐受和调节自身反应性T、B细胞方面起关键性作用［8］。当PD⁃1与PD⁃L1结合形成PD⁃1/PD⁃L1信号通路后，可引发抑制信号的产生，下调细胞因子IL⁃2、IFN⁃γ的分泌及存活蛋白的表达，从而抑制T细胞的免疫反应［9］。Wang等［10］已证实了PD⁃1/PD⁃L1信号对T细胞免疫的负性调控作用。

文献［11］报道，感染H1N1禽流感病毒的患者，T细胞表面的PD⁃L1表达水平与T细胞数量呈负相关，且PD⁃L1促进CD8+T细胞的凋亡并减少细胞因子的分泌，减弱T细胞对H1N1禽流感病毒的免疫反应。研究［12］还发现，高危型HPV患者的宫颈T细胞中PD⁃1和PD⁃L1表达显著增加，并与上皮内瘤样病变分级呈正相关。关于PD⁃1、PD⁃L1在尖锐湿疣患者外周血T淋巴细胞的表达情况目前仍不清楚。本研究结果显示，尖锐湿疣组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1的表达水平均高于对照组，提示PD⁃1/PD⁃L1信号通路参与了尖锐湿疣的T淋巴细胞免疫。尖锐湿疣组外周血CD4+T淋巴细胞计数低于对照组，提示在尖锐湿疣的早期，CD4+T淋巴细胞的增殖已开始受到抑制，但两组CD4+T淋巴细胞计数仍在正常范围内，这可能是由于我们研究的尖锐湿疣组患者病程较短［（2.16±0.48）个月］，均为初发病例，而CD4+和（或）CD8+T细胞数量明显改变并非短期内就能出现的。相关性分析显示，尖锐湿疣组CD4+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1表达水平与CD4+T淋巴细胞计数均呈负相关，提示PD⁃1、PD⁃L1的高表达可能通过PD⁃1/PD⁃L1信号通路抑制了CD4+T淋巴细胞的增殖，导致CD4+T淋巴细胞数量减少。

表2 尖锐湿疣患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞计数、CD4+/CD8+比值、IL⁃2、IFN⁃γ水平（x± s）

CD4+T淋巴细胞根据分泌的细胞因子，可分为Th1和Th2两类细胞。人体对HPV感染反应以Th1细胞介导的细胞免疫为主［13］，以分泌细胞因子IL⁃2和IFN⁃γ为特征。本研究结果显示，尖锐湿疣组外周血IL⁃2、IFN⁃γ水平均低于对照组，且CD4+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1表达水平与IL⁃2水平、IFN⁃γ水平均呈负相关，提示CD4+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1高表达可使Th1细胞介导细胞免疫功能受到抑制，分泌细胞因子IL⁃2、IFN⁃γ减少。此外，尖锐湿疣组CD4+/CD8+比值低于对照组，且尖锐湿疣组CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD⁃1、PD⁃L1的表达水平与CD4+/CD8+比值均呈负相关。一般认为，尖锐湿疣患者CD4+T细胞计数降低而CD8+T细胞计数增高，引起CD4+/CD8+比值降低。也有研究［14］发现，CD8+T细胞计数无明显变化，与我们的研究结果一致。提示CD4+/CD8+比值降低主要是由于CD4+T细胞降低引起，且在尖锐湿疣的细胞免疫缺陷中居主导地位。

本研究结果显示，尖锐湿疣患者外周血T淋巴细胞PD⁃1、PD⁃L1表达上调，PD⁃1/PD⁃L1信号通路增强，可能负向调控了尖锐湿疣患者T淋巴细胞增殖，减少细胞因子分泌，引起HPV清除障碍而导致尖锐湿疣反复发作，提示PD⁃1/PD⁃L1信号通路与尖锐湿疣患者细胞免疫紊乱有一定关系。

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Programmed death⁃1 and programmed death ligand⁃1 expressions on peripheral blood T lymphocytes from patients with condyloma acuminatum and their significance

Chen Huiyong,Yang Wenlin,Lin Li,Huang Xinyu,Yin Jiawen,Chen Jiahui
Department of Dermatology,The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510260,China

ObjectiveTo measure the expressions of programmed death⁃1（PD⁃1）and programmed death ligand⁃1（PD⁃L1）on peripheral blood T lymphocytes of patients with condyloma acuminatum（CA）,and to investigate their role in cellular immunity in these patients.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 30 patients with CA（CA group）and 20 healthy human controls（control group）.Flow cytometry was conducted to detect the expressions of PD⁃1 and PD⁃L1 on the surfaces of peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes,and to determine the counts of CD4+and CD8+T lymphocytes.Enzyme⁃linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to measure the levels of serum interleukin⁃2（IL⁃2）and interferon⁃γ（IFN⁃γ）.Statistical analyses were carried out to compare the above parameters between the two groups,and to assess the relationship of PD⁃1 and PD⁃L1 expressions with the counts of CD4+and CD8+T lymphocytes as well as with the serum levels of IL⁃2 and IFN⁃γ.ResultsThere was a significant increase in the expression rates of PD⁃1 and PD⁃L1 on CD4+T lymphocytes（PD⁃1:9.48% ± 3.31%vs.7.12% ± 2.16%,t=2.81,P＜0.01;PD⁃L1:4.40% ±1.46%vs.3.26% ±1.13%,t=3.16,P＜0.01）and CD8+T lymphocytes（PD⁃1:12.52%±3.17%vs.9.95%±2.17%,t=3.16,P＜0.01;PD⁃L1:7.07%±2.23%vs.5.39%±1.69%,t=2.88,P＜0.01）in the CA group compared with the control group.Moreover,the CA group showed significantly lower counts of CD4+T lymphocytes（727.43 ± 138.59/μlvs.804.25 ± 92.83/μl,t=2.17,P＜ 0.05）and CD4/CD8 ratio（1.23±0.35vs.1.46±0.34,t=2.24,P＜ 0.05）than the control group,while no significant difference was observed in CD8+T lymphocyte counts between the CA group and control group（613.60±121.60/μlvs.572.45±103.08/μl,t=1.24,P＞0.05）.The levels of serum IL⁃2 and IFN⁃γ were both lower in the CA group than in the control group（t=2.12,2.16,respectively,bothP＜ 0.05）.In the CA group,PD⁃1 and PD⁃L1 expression levels on peripheral blood CD4+T lymphocytes were both negatively correlated with CD4+T lymphocyte counts,the CD4/CD8 ratio,as well as IL⁃2 and IFN⁃γ serum levels（allP＜ 0.05）,and those on peripheral blood CD8+T lymphocytes were also negatively correlated with the CD4/CD8 ratio（allP＜ 0.05）,but uncorrelated with CD8+T lymphocyte counts（bothP＞ 0.05）.ConclusionPD⁃1 was highly expressed on peripheral blood T lymphocytes from patients with CA,which may inhibit T lymphocyte⁃mediated immune response,decrease CD4+T lymphocyte counts,the CD4/CD8 ratio as well as IL⁃2 and IFN⁃γ serum levels by interacting with its ligand PD⁃L1 and forming the PD⁃1/PD⁃L1 signaling pathway.

Condylomata acuminata;T⁃lymphocytes;Programmed death⁃1;Programmed death ligand⁃1

Yang WL,Email:yangwenlin@21cn.com

杨文林，Email：yangwenlin@21cn.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.08.006

2016⁃02⁃14）

（本文编辑：周良佳 颜艳）