副银屑病皮损及外周血TCRγ基因重排的检测及其临床意义探讨

王晓明 薛峰 郑捷

200025上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科

副银屑病皮损及外周血TCRγ基因重排的检测及其临床意义探讨

王晓明 薛峰 郑捷

200025上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科

目的检测副银屑病患者皮损及外周血TCRγ基因重排并探讨其临床意义。方法20例副银屑病患者，采用BIOMED⁃2多重PCR扩增体系检测其皮肤及外周血TCRγ链基因重排，分析TCRγ基因重排与患者一般资料、临床类型、组织病理表现（非特异表现和非典型表现）的相关性。结果20例副银屑病患者皮损中，7例TCRγ基因重排阳性。11例外周血TCRγ基因重排检测中3例阳性，其中2例皮损检测亦阳性。皮损及外周血TCRγ基因重排与患者性别、年龄、病程、临床类型均无关（P＞0.05），而皮损TCRγ基因重排阳性与蕈样肉芽肿相关不典型表现有关（P＜0.05）。20例患者平均随访（44.85±18.48）个月，1例进展为蕈样肉芽肿，2例痊愈。结论副银屑病患者皮损TCRγ基因重排阳性可能与蕈样肉芽肿相关不典型表现有关，结合组织病理不典型表现，提示有进展为蕈样肉芽肿的可能。

类银屑病；基因重排，γ链T细胞抗原受体；蕈样真菌病

副银屑病是一组病因未明的慢性鳞屑性炎症性皮肤病，由于皮损形态不一，病理又无特异性改变，故有时诊断较为困难，尤其是与早期蕈样肉芽肿（mycosis fungoides，MF）的鉴别。目前学者们对副银屑病与早期MF间的关系持不同观点，WHO分类认为小斑块型为良性疾病，而大斑块型是肿瘤前的淋巴增生性疾病［1］。但近年来，副银屑病进展为MF的案例屡有报道［2⁃6］。TCR基因重排检测可作为MF与良性炎症性疾病的辅助鉴别手段，但有文献报道［2⁃3，5，7⁃10］，副银屑病患者皮损或外周血中也可出现TCR基因重排阳性。我们检测副银屑病患者皮损和（或）外周血TCR基因重排，探讨其临床意义。

材料和方法

一、材料

1.标本来源：2009年4月至2014年8月就诊于上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科的20例经临床和组织病理确诊的副银屑病患者，临床表现为淡红色或红褐色斑疹、斑丘疹、丘疹，上覆少量鳞屑，刮之无点状出血现象，无自觉症状或稍有瘙痒，慢性病程。

2.主要试剂和仪器：DNeasy Blood&Tissue Kit（德国Qiagen公司），甲酰胺、Taq酶、Genescan⁃500LIZ、PCR扩增仪、DNA3130XL序列测定仪（美国ABI公司），Peak Scanner Software v1.0（德国Applied Biosystems公司），紫外分光光度计（上海昂拉仪器有限公司）。

二、方法

1.皮肤及外周血TCRγ基因重排检测（TCR⁃γ⁃PCR⁃GSA方法）：①外周血及皮肤DNA的抽提：用DNeasy Blood&Tissue Kit抽提外周血及粉碎后的皮损处皮肤组织DNA，具体步骤按说明书操作；②模板DNA浓度及纯度测定：用紫外分光光度计于260～280 nm波长下测量抽提的DNA样本吸光度（A值），A260/A280值在1.8～2.0间即为纯DNA样本；③PCR扩增：TCRγ基因引物 VγJγ设计参照BIOMED⁃2法［11］，引物序列如表1所示；④PCR产物基因扫描：将荧光引物扩增的PCR产物进行基因扫描，采用ABIDNA3130XL序列测定仪测定，并使用Peak Scanner Software v1.0分析。上述TCRγ基因重排的检测，每个样本至少重复1次，若2次结果不一致，则进行第3次检测，以至少有2次可重复性结果作为最终结果。

2.组织病理分析：20例副银屑病病理表现归为2种类型，一种为非特异性表现：表皮正常，或出现海绵水肿，可有淋巴细胞外渗，真皮浅层小血管周围淋巴组织细胞浸润，且无异形细胞；另一种为不典型表现，即与MF相关的表现：真表皮之间线性排列的淋巴细胞，紧密结合在基底层细胞，细胞可有异形性，淋巴细胞有时会聚集。

3.临床随访观察：自检测皮损及外周血TCRγ基因重排之日起至2015年10月31日，对患者的临床过程及预后进行随访观察。

表1 TCRγ基因引物序列

4.统计学方法：采用SPSS12.0统计软件，正态分布数据以x±s表示，不符合者以中位数M（P25～P75）表示。正态分布的计量资料采用独立样本t检验，非正态分布则采用秩和检验。计数资料R×C列联表采用Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、临床资料

20例副银屑病患者中，男8例，女12例，年龄7～74（47.9±17.07）岁，病程0～20年，中位病程2.5年。如表2所示，20例患者中，点滴型9例，大斑块型3例，小斑块型8例，所有患者均进行了皮损TCRγ基因重排检测，共7例阳性，分别为点滴型2例，大斑块型2例，小斑块型3例；11例（点滴型6例、大斑块型2例、小斑块型3例）进行了外周血TCRγ基因重排检测，共3例阳性，分别为点滴型1例，小斑块型2例，后2例皮损检测亦为阳性。组织病理出现不典型表现者6例，分别为大斑块型3例、小斑块型2例、点滴型1例。

二、皮损TCRγ基因重排与患者性别、年龄、病程、临床类型、组织病理表现的关系

皮损TCRγ基因重排阳性的7例患者年龄（50.71±15.03）岁，13例阴性患者（46.38±18.47）岁，两组比较，t=0.531，P=0.602；阳性组病程［M（P25～P75）为2（2 ～ 5）年，阴性组3（1 ～ 4）年，两组经秩和检验，差异无统计学意义（P=0.643）。皮损TCRγ基因重排与性别、临床类型均无关（均P＞0.05）。7例阳性者中5例有不典型病理表现，13例阴性者中仅1例有不典型病理表现，差异有统计学意义（P＜0.05），即皮损TCRγ基因重排阳性与MF相关不典型表现有关。见表2。

三、外周血TCRγ基因重排与性别、年龄、病程、临床类型及病理表现的关系

3例外周血TCRγ基因重排阳性患者中2例皮损基因重排阳性，而8例外周血阴性患者中5例皮损阴性。3例外周血TCRγ基因重排阳性患者年龄（55.67±3.22）岁，8例阴性患者（39.5±16.05）岁，两组比较，t=1.667，P=0.128；阳性组中位病程2年，阴性组3年，两组经秩和检验，差异无统计学意义（P=0.776）。外周血TCRγ基因重排与性别、临床类型及病理表现无关，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

四、随访观察

20例副银屑病患者自检测TCRγ基因重排之日起随访16～80（44.85±18.48）个月。自皮损初发的时间为16～282（89.5±55.88）个月。2例痊愈（点滴型1例，小斑块型1例）；1例大斑块型患者在随访第18个月时通过病理检查确诊为MF，其前后2次病理表现见图1，此例患者2次皮肤及外周血TCRγ基因重排结果一致（皮损检测阳性，外周血检测阴性）。17例患者病情反复（8例点滴型，2例大斑块型，7例小斑块型），但尚无皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）或其他肿瘤发生，继续随访中。

表2 副银屑病患者皮损与外周血TCRγ基因重排与患者性别、临床类型及病理表现的关系（例）

讨 论

PCR方法检测TCR基因重排可以发现皮损及外周血中的T细胞克隆，为诊断CTCL提供重要线索。针对TCR中α、β、δ和γ 4种链的结构，目前可分别设计V区和J区通用引物进行PCR。但在CTCL患者中，TCRγ基因重排几乎出现在所有T细胞淋巴瘤，其频率高于其他3条链，而且γ基因的结构相对简单，没有可变D区域，利于设计PCR引物，扩增出更多可能的基因重排方式。因此，本研究选择TCRγ基因作为TCR的克隆性分析的对象［12］。

本研究7例副银屑病患者皮损TCRγ基因重排阳性，包括3例点滴型、2例大斑块型及3例小斑块型。11例外周血TCRγ基因重排检测中3例阳性，包括 1 例点滴型及 2例小斑块型。研究［2⁃3，7⁃8］显示，大斑块型皮损TCR基因重排阳性率为0～50%，Simon等［2］检测12例大斑块型皮损TCRγ基因重排，6例阳性。小斑块型皮损TCR基因重排阳性率为0 ～ 66.7%［2⁃3，7⁃8］。Klemke等［3］分析了 5 例小斑块型皮损TCRγ基因重排，2例阳性。而Bernier等［7］分析20例小斑块型皮损TCRγ基因重排，未发现阳性者。文献［13⁃15］显示，良性炎症性疾病（包括湿疹、银屑病、扁平苔藓、痒疹、药疹等）皮损TCRγ基因重排阳性率为0～21.7%。既往研究中，66.7%（14/21）CTCL患者皮损TCRγ基因重排阳性，且皮损处阳性率较外周血高［16］。本研究结果与既往文献比较，副银屑病（尤其是大斑块型）皮损TCRγ基因重排阳性率较高，与CTCL相近，故认为副银屑病的TCRγ基因重排阳性的意义值得探讨。

本研究中分别有3例大斑块型、1例小斑块型及1例点滴型出现不典型病理表现，且不典型病理表现与皮损TCRγ基因重排有关，即皮损TCRγ基因重排阳性患者易出现不典型病理表现。Väkevä等［17］回顾分析105例副银屑病患者的病理表现，发现85%小斑块型和54%大斑块型可出现不典型表现，但该研究未检测TCR基因重排情况。Bernier等［7］分析了88例副银屑病患者的组织病理，显示15%小斑块型和23.5%大斑块型有不典型表现。因此，皮损TCRγ基因重排阳性可能提示淋巴细胞的一种克隆增生模式，或可提示疾病的进展变化。本研究还显示，外周血TCRγ基因重排与不典型病理表现无关。也有研究显示，外周血TCRγ基因重排阳性患者均无不典型病理表现［7］，或未发生 CTCL［8］。因此，我们认为皮损中TCRγ基因重排阳性比外周血更具特异性，更有意义。

研究认为，从出现皮损至病理确诊MF需要48～72个月［18］，本研究从患者出现皮损开始随访16～282个月。1例皮损TCRγ基因重排阳性的大斑块型患者在随访第18个月时通过组织病理确诊进展为MF，且其前后两次组织病理显示其初始的不典型表现逐步发展为典型早期MF的病理特点。既往研究显示，10%～46%大斑块型可进展为MF［4，17］。Simon等［2］对12例大斑块型患者平均随访9年，1例发展为MF，且为皮损TCRγ基因重排阳性者。Väkevä等［17］对36例大斑块型患者平均随访6年，35%进展为MF，其中16%早期组织病理有不典型表现，但研究未进行基因重排检测。Bernier等［7］长期随访发现，皮损TCR基因重排阳性的大斑块型进展为MF的概率是单纯根据临床病理诊断者的4倍［9］。因此，我们认为同时有皮损TCRγ基因重排阳性及不典型病理表现的大斑块型应与其他大斑块型区分开来，认为其有更高的概率发展为MF，二者结合对预测患者进展为MF有较大帮助，应加强对这类患者的随访观察。

尽管WHO分类认为小斑块型为良性疾病，但也有较多进展为MF的报道。本研究虽然病例数少，但显示小斑块型患者外周血TCRγ基因重排阳性率较高。Muche等［8］和Klemke等［3］研究显示，小斑块型患者外周血TCR基因重排阳性率较高，分别为64.3%、40%，但其实际临床意义尚未明确，被称为“未确定意义的T细胞克隆”。75岁以上正常老年人可出现外周血TCR基因重排阳性［19］，但本研究3例患者均为75岁以下，故其临床意义仍需进一步研究。Väkevä等［17］平均随访10年，发现10%小斑块型进展为MF，但未进行TCR基因重排检测。本研究随访时间内未发现进展为MF的小斑块型患者。Belousva等［5］报道1例小斑块型进展为MF，该患者的外周血及新发生的斑块皮损TCRγ基因重排阳性，而陈旧斑片皮损为阴性，鉴于小斑块型外周血TCRγ基因重排阳性率较其他临床类型及皮损处高，我们认为对伴有不典型病理表现的小斑块型病例，应当重视对其随访。

本研究9例点滴型患者皮损TCRγ基因重排检测中有3例阳性。Shieh等［10］研究显示，点滴型皮损TCR基因重排阳性率为50%，这种差异可能是样本量较小所致。此外，本研究1例点滴型患者的外周血TCRγ基因重排阳性，相对其他临床类型也无明显差异。本研究显示，点滴型患者TCRγ基因重排阳性率相对低，且临床过程多呈现良性慢性反复，有痊愈病例，无进展为MF的病例。既往文献缺乏对点滴型患者TCR基因重排的分析，也鲜有点滴型进展为MF的案例［6］。因此，我们认为点滴型并非早期MF，但其TCRγ基因重排阳性的意义仍需进一步研究。

本研究显示，副银屑病患者的TCRγ基因重排阳性与性别、年龄、病程、临床类型无明显相关性，但皮损TCRγ基因重排与不典型病理表现显著相关。随访中1例发展为MF，提示副银屑病尤其是斑块型可能与MF有关。皮损TCRγ基因重排阳性结合组织病理的不典型表现，可更好地提示进展为MF的可能性。这一结论还需大样本研究证实。

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Detection of TCRγ gene rearrangements in skin lesions and peripheral blood of patients with parapsoriasis and their clinical significance

Wang Xiaoming,Xue Feng,Zheng Jie
Department of Dermatology,Ruijin Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

ObjectiveTo detect TCRγ gene rearrangements in skin lesions and peripheral blood of patients with parapsoriasis,and to study their clinical significance.MethodsTotally,20 patients with parapsoriasis were included in this study.BIOMED⁃2 multiplex PCR was performed to detect TCRγ gene rearrangements in lesional skin（n=20）and peripheral blood（n=11）samples from the patients with parapsoriasis.Statistical analysis was performed to assess the relationship of TCRγ gene rearrangements with clinical types of parapsoriasis as well as general information and histopathological manifestations（including non⁃specific manifestations and atypical manifestations）of patients.ResultsTCRγ gene rearrangements were positive in lesional skin from 7 of the 20 patients,in peripheral blood from 3 of 11 patients,and in both lesional skin and peripheral blood from 2 patients.Positive TCRγ gene rearrangements in skin lesions were significantly correlated with mycosis fungoides（MF）⁃related atypical histopatho⁃logical manifestations（P＜ 0.05）,but those in neither skin lesions nor peripheral blood were correlated with gender and age of patients or clinical course and types of parapsoriasis（allP＞ 0.05）.During an average follow⁃up time of 44.85 ±18.48 months,1 case progressed into MF,and 2 were cured.Conclusions Positive TCRγ gene rearrangements in skin lesions of patients with parapsoriasis may be correlated with MF⁃related atypical manifestations.The presence of TCRγ gene rearrangements and atypical histopathological manifestations may suggest the possibility of progression from parapsoriasis into MF.

Parapsoriasis;Gene rearrangement,gamma⁃chain T⁃cell antigen receptor;Mycosis fungoides

Zheng Jie,Email:jie⁃zheng2001@126.com

郑捷，Email：jie⁃zheng2001@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.08.010

2015⁃11⁃19）

（本文编辑：周良佳 颜艳）