腺苷对人毛囊生长的促进作用及对血管生成素表达的影响

李艳 王淼淼 李敏 周乃慧

215006苏州大学附属第一医院皮肤科

腺苷对人毛囊生长的促进作用及对血管生成素表达的影响

李艳 王淼淼 李敏 周乃慧

215006苏州大学附属第一医院皮肤科

目的探讨腺苷对人毛囊生长的促进作用及对血管生成素表达的影响。方法分离完整的人头皮生长期毛囊，分成6组，分别加入0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L腺苷作用，每个浓度组再分成两个亚组，其中一个亚组加入0.8 mg/L抗人血管生成素抗体，另外一个亚组不加抗体，显微镜下测量6 d内毛囊的生长长度。利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞，分组同上，作用48 h后，噻唑蓝法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期，逆转录（RT）⁃PCR和ELISA分别检测人毛乳头细胞血管生成素mRNA和细胞上清液中血管生成素蛋白的表达。结果与不加腺苷的对照组相比，10～1 000 μmol/L腺苷能够明显促进体外培养的人毛囊生长（F=377.776，P＜0.05），其中以100 μmol/L腺苷的促进作用最为显著（P＜0.05），加入抗人血管生成素抗体能够部分拮抗腺苷促进人毛囊生长的作用。与对照组相比，0.1～1 000 μmol/L腺苷能够明显促进体外培养的人毛乳头细胞增殖（F=230.067，P＜0.05），其中以10 μmol/L和100 μmol/L腺苷促进细胞增殖的作用最为显著（均P＜0.05），加入抗人血管生成素抗体能够部分拮抗腺苷促进细胞增殖的作用。流式细胞仪检测显示，与对照组相比，10～1 000 μmol/L腺苷能够显著下调毛乳头细胞G1期细胞比例（F=75.5，P＜0.05），并显著上调G2期（F=15.7，P＜ 0.05）和S期（F=81.8，P＜ 0.05）细胞比例。而且，与对照组相比，10 μmol/L和100 μmol/L腺苷能够明显促进毛乳头细胞表达血管生成素mRNA（F=942.630，P＜0.05）和血管生成素蛋白（F=148.544，P＜0.05）。结论 腺苷在体外具有促进人毛囊生长和毛乳头细胞增殖的作用，其机制可能与上调血管生成素表达有关。

腺苷；血管生成素类；毛囊；细胞增殖；细胞周期；毛乳头细胞

腺苷是一种内源性嘌呤核苷酸，由三磷酸腺苷逐步脱磷酸化形成，具有扩张血管及减轻组织缺血性损伤等多种生物学效应。研究发现，人毛囊毛乳头细胞和外毛根鞘细胞均能表达腺苷受体，腺苷与其受体结合后激活一系列信号转导途径，具有促进毛发生长的作用，其机制可能与上调血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和成纤维细胞生长因子7（fibroblast growth factor⁃7，FGF⁃7）的表达有关［1⁃2］，但确切机制尚不明确。以往研究［3⁃6］证实，血管生成素是一种新的毛囊起源的血管生成因子，在体内和体外均具有促进毛囊生长和毛乳头细胞增殖的作用，而腺苷能否调控毛囊及毛囊细胞中血管生成素的表达，目前尚未见报道。因此，我们探讨腺苷对体外培养的人毛囊生长的作用及对血管生成素表达的影响。

材料与方法

一、主要试剂与仪器

人枕部头皮取自本院脑外科6例颅脑外伤患者手术切除的头皮，年龄30～45岁，离体6 h以内。本研究通过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。L⁃谷氨酰胺、分离酶、胰蛋白酶、胶原酶、胎牛血清和Williams E培养基（含2 mmol/L L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素）均产自美国Gibco公司，Dulbecco Modified Eagle Media（DMEM，美国Hyclone公司），抗人血管生成素抗体和血管生成素ELISA试剂盒（美国R&D公司），Trizol Reagent（美国Invitrogen公司），TaKaRa RNA PCR试剂盒（AMV）Ver.3.0（大连TaKaRa公司），碘化丙啶（美国Molecular probe公司）。680型酶标仪（美国Bio⁃Rad公司），流式细胞仪FACScan（美国Becton公司）。

二、方法

1.人毛囊培养及生长测定：人毛囊分离参见文献［7］。手术切除的标本常规消毒后，用手术刀片将真皮和皮下组织交界处分开，解剖显微镜下用眼科镊拔出皮下脂肪中的毛囊，选择完整的生长期Ⅳ期毛囊用于实验。毛囊培养采用24孔板，每孔1个毛囊，加500 μl Williams E培养基。实验分为6组，分别加入0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L腺苷，每个浓度再分成两个亚组，一个加入终浓度为0.8 mg/L抗人血管生成素抗体，另外一个不加抗体，抗人血管生成素抗体的终浓度设定参见文献［3］，每组8个复孔，隔天换液1次，共同培养6 d，于第0天和第6天分别在显微镜下测量每根毛囊的长度，两次的差值即为该毛囊6 d内的生长长度。

2.人毛乳头细胞培养及增殖实验：人毛乳头细胞培养采用两步酶消化法，参见文献［8⁃9］。分离得到纯化的毛乳头以DMEM（含15%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素）悬浮后接种于25 cm2培养瓶，2～3周后细胞大部分生长融合。取对数生长期的第3代人毛乳头细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以1.5×105/ml的密度接种于96孔板，每孔100 μl，待细胞贴壁后换用无血清DMEM，加入0、0.1、1、10、100、1 000 μmol/L腺苷，每个浓度再分成两个亚组，一个加入终浓度为0.8 mg/L抗人血管生成素抗体，另外一个不加抗体，每组6个复孔。培养48 h后，每孔加噻唑蓝（MTT，5 g/L）15 μl，37 ℃孵育4 h后弃去培养基，每孔加150 μl二甲基亚砜（DMSO），避光，充分振荡混匀，酶标仪下于490 nm波长处测定吸光度值（A490）。以A490值代表细胞增殖活性。

3.细胞周期测定：取对数生长期的第3代人毛乳头细胞，接种于25 cm2培养瓶（每瓶1.2×106个细胞），细胞贴壁后换用无血清培养基，加入腺苷，使其终浓度分别为0、0.1、1、10、100和1 000 μmol/L，每个浓度3瓶细胞。48 h后，采用0.25%胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤2次，离心收集细胞，以75%冷乙醇固定，-20℃保存。检测时，PBS洗涤细胞3次，加入200 μl含50 mg/L Triton的碘化丙啶，振荡成单细胞悬液，避光，室温静置30 min，300目滤网过滤，流式细胞仪检测细胞周期。

4.半定量RT⁃PCR检测血管生成素mRNA的表达：取对数生长期的第3代人毛乳头细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以1.5×105/ml的密度接种于6孔板，每孔2 ml，待细胞贴壁后换用无血清DMEM，加入0、10、100 μmol/L腺苷，培养48 h后，收集细胞上清液于10 ml离心管内，2 000×g离心5 min，以去除杂质，上清液按1次用量分装，-20℃保存，用于下列试验。细胞以预冷的PBS洗涤后，按TRizol试剂盒提取总RNA，将其终浓度调整为200 mg/L。按照试剂盒说明，取200 ng总RNA进行反转录。人血管生成素：上游引物5′⁃CCTGGGCGTTTTGTTGTTGG⁃3′，下游引物5′⁃TGTGGCTCGGTACTGGCATG⁃3′，产物大小为352 bp；人3磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）：上游引物 5′⁃CTGAGCTGAACGGGAAGCTCAC⁃3′，下游 引 物 5′⁃GCTCAGTGTAGCCCAGGATGC⁃3′，产物大小为220 bp。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，62℃退火10 s，72℃延伸14 s，总共30个循环，最后72℃终末延伸7 min。扩增结束后，取10 μl进行电泳检测，并用Gene Tools软件进行血管生成素mRNA相对表达量分析。

5.ELISA检测血管生成素蛋白表达：取方法4中收集的细胞上清液，按ELISA试剂盒说明检测血管生成素蛋白含量。

6.统计学分析：实验数据以SPSS17.0统计软件进行统计学分析，结果以±s表示，采用单因素方差分析和独立样本的t检验，两两比较采用最小显著差异（LSD）检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、腺苷对人毛囊生长的影响及抗人血管生成素抗体对腺苷的拮抗作用

培养6 d后，与对照组相比，10、100和1 000 μmol/L腺苷能够显著促进人毛囊生长（均P＜0.05），其中以100 μmol/L腺苷作用最为显著（P＜0.05）。与不加血管生成素抗体的同一浓度腺苷组相比，加入血管生成素抗体后10、100、1 000 μmol/L腺苷组人毛囊的生长受到显著抑制（均P＜0.05），但仍快于对照组（均P＜0.05）。见表1。

二、腺苷对人毛乳头细胞增殖的影响

作用48h后，与对照组相比，0.1～1000μmol/L腺苷均能够明显促进人毛乳头细胞增殖（均P＜0.05），其中以 10 μmol/L 和 100 μmol/L 腺苷促进细胞增殖的作用最为显著（均P＜0.05），而10 μmol/L与100 μmol/L腺苷组间差异无统计学意义（P＞0.05）。与不加血管生成素抗体的同一浓度腺苷组相比，加入血管生成素抗体后，0.1、1、10、100、1 000 μmol/L腺苷组毛乳头细胞的增殖受到显著抑制（P＜0.05），但仍快于对照组（均P＜0.05）。见表2。

三、腺苷对人毛乳头细胞周期的影响

作用48 h后，与对照组相比，10、100、1 000 μmol/L腺苷组G1期细胞比例显著降低（均P＜0.05），G2期和S期细胞比例显著增高（均P＜0.05）。100 μmol/L腺苷组G1期细胞比例明显低于10 μmol/L和1 000 μmol/L腺苷组（均P＜0.05），且G2期和S期细胞比例明显高于10 μmol/L和1 000 μmol/L腺苷组（均P＜0.05），但10 μmol/L与1 000 μmol/L腺苷组相比，G1期、G2期和S期细胞比例差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表1 不同浓度腺苷作用于含或不含血管生成素抗体的毛囊6 d后毛囊生长长度比较（mm±s）

表1 不同浓度腺苷作用于含或不含血管生成素抗体的毛囊6 d后毛囊生长长度比较（mm±s）

注：n=8。a：与同一亚组对照组相比，P＜0.05；e：与同一亚组0.1 μmol/L腺苷组相比，P＜0.05；d：与同一亚组1 μmol/L腺苷组相比，P＜ 0.05；e：与同一亚组10 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05；e：与同一亚组100 μmol/L腺苷组相比，P＜0.05

腺苷浓度（μmol/L）0（对照组）0.1 1 10 100 1 000 F值P值注：n=8。a：与同一亚组对照组相比，P ＜ 0.05；b：与同一亚组0.1 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05；c：与同一亚组1 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05；d：与同一亚组10 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05；e：与同一亚组100 μmol/L腺苷组相比，P＜0.05血管生成素抗体不含1.23±0.04 1.25±0.04 1.26±0.03 1.49±0.02abc 1.80±0.05abcd 1.66±0.02abcde 377.776＜0.01 t值P值含1.23±0.03 1.24±0.03 1.25±0.03 1.43±0.01abc 1.53±0.02abcd 1.43±0.02abce 209.894＜0.01 0.070 0.629 0.271 8.647 13.214 23.635＞0.05＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01表2 不同浓度腺苷作用于含或不含血管生成素抗体的毛乳头细胞48 h后毛乳头细胞的增殖活性比较（A490，±s）腺苷浓度（μmol/L）0（对照组）0.1 1 10 100 1 000 F值P值血管生成素抗体不含0.246±0.005 0.260±0.003a 0.269±0.003ab 0.312±0.004abc 0.314±0.007abc 0.292±0.003abcde 230.067＜0.01含0.246±0.005 0.253±0.003a 0.260±0.004ab 0.272±0.004abc 0.272±0.003abc 0.267±0.003abcde 50.165＜0.01 t值0.114 3.792 4.198 17.231 13.000 15.386 P值＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表2 不同浓度腺苷作用于含或不含血管生成素抗体的毛乳头细胞48h后毛乳头细胞的增殖活性比较（A490±s）

表2 不同浓度腺苷作用于含或不含血管生成素抗体的毛乳头细胞48h后毛乳头细胞的增殖活性比较（A490±s）

注：n=6。a：与同一亚组对照组相比，P ＜ 0.05；b：与同一亚组0.1 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05；c：与同一亚组1 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05；d：与同一亚组10 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05；e：与同一亚组100 μmol/L腺苷组相比，P＜0.05

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四、腺苷对人毛乳头细胞血管生成素mRNA表达的影响

见图1。0、10、100 μmol/L腺苷作用人毛乳头细胞48 h后，血管生成素mRNA的相对表达量分别为0.346±0.014、0.594±0.009和0.755±0.012。与对照组相比，10、100 μmol/L腺苷能够明显促进人毛乳头细胞表达血管生成素mRNA（F=942.630，P＜0.05），且100 μmol/L腺苷组血管生成素mRNA相对表达量明显高于10 μmol/L腺苷组（P＜0.05）。

表3 不同浓度腺苷作用48 h后毛乳头细胞细胞周期分布（±s）

表3 不同浓度腺苷作用48 h后毛乳头细胞细胞周期分布（±s）

注：n=3。a：与对照组相比，P ＜ 0.05；b：与0.1 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05；c：与1 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05；d：与10 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05；e：与100 μmol/L腺苷组相比，P ＜ 0.05

腺苷浓度（μmol/L）0（对照组）0.1 1 10 100 1 000 F值P值细胞周期（%）G1 94.73±0.64 93.66±0.77 93.39±0.22 88.41±1.06abc 84.63±0.73abcd 88.57±1.03abce 75.5＜0.01 G2 2.83±0.51 2.99±0.60 3.19±0.24 4.25±0.28abc 5.89±0.86abcd 4.18±0.17abce 15.7＜0.01 S 1.46±0.15 2.32±0.19 2.30±0.22 6.93±1.06abc 8.71±0.33abcd 6.69±0.86abce 81.8＜0.01

图1 不同浓度腺苷对人毛乳头细胞血管生成素mRNA表达的影响 M：标准参照物；1～3：分别示0、10和100 μmol/L腺苷组血管生成素的表达；4～6：分别示0、10和100 μmol/L腺苷组3磷酸甘油醛脱氢酶的表达

五、腺苷对人毛乳头细胞上清液中血管生成素蛋白表达的影响

ELISA检测显示，10和100 μmol/L腺苷组细胞上清液中血管生成素蛋白的浓度分别为（251.484±9.869）ng/L和（278.296± 4.249）ng/L，明显高于对照组［（185.20 ± 4.869）ng/L，F=148.544，P＜0.05］，且100 μmol/L腺苷组明显高于10 μmol/L腺苷组（P＜0.05）。

讨 论

毛囊最为显著的特点是始终处于生长期、退行期和休止期的周期性循环中。在毛囊的形态学发生和周期性循环中，许多激素、生长因子、细胞因子及其受体等相互作用，共同调控毛发的生长与脱落［10］。腺苷作为一种内源性嘌呤核苷酸，在体内具有扩张血管、保护组织缺血性损伤等多种生物学效应，以往的研究发现，腺苷具有促进毛发生长的作用，其机理可能与上调VEGF和FGF⁃7的表达有关［1⁃2］。血管生成素是一种新的具有促进毛发生长的血管生成因子，到目前为止尚不明确腺苷是否能够调控毛囊及毛囊细胞中血管生成素的表达。

本研究显示，10～1 000 μmol/L腺苷能够明显促进人毛囊生长，其中以100 μmol/L腺苷作用最为显著；0.1～1 000 μmol/L腺苷能够明显促进体外培养的人毛乳头细胞增殖，其中以10 μmol/L和100 μmol/L腺苷作用最为显著。流式细胞仪检测发现，10～1 000 μmol/L腺苷能够明显促进毛乳头细胞由G1期进入G2期和S期，从而发挥促进细胞增殖的作用。提示腺苷在体外具有促进人毛囊生长和毛乳头细胞增殖的作用。鉴于毛乳头细胞在毛囊的生长发育及周期性循环中起关键作用，毛乳头细胞的数量在一定程度上决定了毛囊的直径及毛发的粗细［11］，因此腺苷在体外促进人毛囊生长可能与其促进毛乳头细胞增殖有关。

为进一步探讨腺苷促进毛囊生长和毛乳头细胞增殖的可能作用机制，我们在不同浓度腺苷作用的毛囊和毛乳头细胞中同时加入抗人血管生成素抗体，结果显示，抗人血管生成素抗体能够部分拮抗腺苷对人毛囊生长和毛乳头细胞增殖的促进作用，半定量RT⁃PCR和ELISA检测结果发现，腺苷能够上调人毛乳头细胞表达血管生成素mRNA和蛋白。由此可见，腺苷在体外具有促进人毛囊生长的作用，其机制可能与促进毛乳头细胞增殖有关，腺苷诱导表达的血管生成素部分参与腺苷促进人毛囊生长和毛乳头细胞增殖的作用。但是，腺苷在体内是否同样具有促进毛发生长的作用及其如何调控血管生成素的表达仍有待进一步深入研究。

［1］Li M,Marubayashi A,Nakaya Y,et al.Minoxidil⁃induced hair growth is mediated by adenosine in cultured dermal papilla cells:possible involvement of sulfonylurea receptor 2B as a target of minoxidil［J］.J Invest Dermatol,2001,117（6）:1594⁃1600.DOI:10.1046/j.0022⁃202x.2001.01570.x.

［2］Iino M,Ehama R,Nakazawa Y,et al.Adenosine stimulates fibroblast growth factor⁃7 gene expression via adenosine A2b receptor signaling in dermal papilla cells［J］.J Invest Dermatol,2007,127（6）:1318⁃1325.DOI:10.1038/sj.jid.5700728.

［3］Zhou N,Fan W,Li M.Angiogenin is expressed in human dermal papilla cells and stimulates hair growth［J］.Arch Dermatol Res,2009,301（2）:139⁃149.DOI:10.1007/s00403⁃008⁃0907⁃5.

［4］周乃慧,范卫新,李梅云.血管生成素在人毛囊中的表达及其对毛发生长的影响［J］.中华皮肤科杂志,2009,42（1）:34⁃37.Zhou NH,Fan WX,Li MY.Expression of angiogenin in human hair follicle and its effect on hair growth［J］.Chin J Dermatol,2009,42（1）:34⁃37.

［5］周乃慧,范卫新.血管生成素在小鼠皮肤中的表达及其对小鼠毛发生长的影响［J］.临床皮肤科杂志,2011,40（11）:653⁃656.Zhou NH,Fan WX.The expression of angiogenin in the mouse skin and its role in promoting hair growth［J］.J Clin Dermatol,2011,40（11）:653⁃656.

［6］周乃慧,范卫新.血管生成素对人毛囊外毛根鞘角质形成细胞增殖的影响［J］.临床皮肤科杂志,2011,40（6）:328⁃331.Zhou NH,Fan WX.The proliferative effects of angiogenin on human outer root sheath keratinocytes［J］.J Clin Dermatol,2011,40（6）:328⁃331.

［7］Philpott MP,Green MR,Kealey T.Human hair growthin vitro［J］.J Cell Sci,1990,97（Pt 3）:463⁃471.

［8］程波,刘荣卿,伍津津,等.改良毛乳头细胞培养法［J］.中华皮肤科杂志,2001,34（5）:387⁃388.Cheng B,Liu RQ,Wu JJ,et al.A modified method for culture of dermal papilla cells［J］.Chin J Dermatol,2001,34（5）:387⁃388.

［9］朱海琴,范卫新,张卉.黄芩苷对人毛囊生长和毛乳头细胞分泌血管内皮生长因子的影响［J］.中华皮肤科杂志,2007,40（7）:416⁃418.Zhu HQ,Fan WX,Zhang H.In vitroeffects of baicalin on the growth ofhuman hairfolliclesand secretion ofvascular endothelial growth factor by human dermal papilla cells［J］.Chin J Dermatol,2007,40（7）:416⁃418.

［10］Stenn KS,Paus R.Controls of hair follicle cycling［J］.Physiol Rev,2001,81（1）:449⁃494.

［11］Chi W,Wu E,Morgan BA.Dermal papilla cell number specifies hair size,shape and cycling and its reduction causes follicular decline［J］.Development,2013,140（8）:1676 ⁃1683.DOI:10.1242/dev.090662.

Promotive effects of adenosine on human hair follicle growth and angiogenin expression

Li Yan,Wang Miaomiao,Li Min,Zhou Naihui
Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China Corresponding author:Zhou Naihui,Email:zhounaihui@163.com

ObjectiveTo evaluate the promotive effects of adenosine on human hair follicle growth and angiogenin expression.MethodsIntact human hair follicles in the anagen phase were isolated from the scalp,and then divided into 6 groups to be treated with adenosine at different concentrations of 0,0.1,1,10,100 and 1 000 μmol/L respectively.Each adenosine group was further divided into 2 subgroups to be treated either with or without 0.8 mg/L anti⁃human angiogenin antibody,and hair follicles receiving no treatment served as the control group.The growth length of hair follicles during 6⁃day culture was measured by using a microscope.Human dermal papilla cells were isolated by a two⁃step enzyme digestion method,and then classified into the same groups as above.After 48⁃hour culture,methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to evaluate cellular proliferative activity,flow cytometry to analyze cell cycle,reverse transcription（RT）⁃PCR to measure the mRNA expression of angiogenin in dermal papilla cells,and enzyme⁃linked immunosorbent assay（ELISA）to measure the protein expression of angiogenin in the culture supernatant of dermal papilla cells.ResultsCompared with the control group,the 10-1 000 μmol/L adenosine⁃treated groups showed significantly increased growth of hair folliclesin vitro（F=377.776,P＜ 0.05）,and 100 μmol/L adenosine had the strongest promotive effect（P＜ 0.05）.However,anti⁃human angiogenin antibody could partly antagonize the promotive effect.Compared with the control group,the proliferative activity of human dermal papilla cells was significantly enhanced in the 0.1-1 000 μmol/L adenosine⁃treated groups（F=230.067,P＜ 0.05）,and adenosine at 10 and 100 μmol/L had the strongest enhancing effects（bothP＜ 0.05）.Similarly,anti⁃human angiogenin antibody could partly antagonize the enhancing effects of adenosine on cell proliferation.As flow cytometry showed,compared with the control group,the 10-1 000 μmol/L adenosine⁃treated groups showed significantly lower proportions of dermal papilla cells in G1 phase（F=75.5,P＜ 0.05）,but higher proportions of cells in G2 phase（F=15.7,P＜ 0.05）and S phase（F=81.8,P＜ 0.05）.In addition,the mRNA and protein expressions of angiogenin were significantly up⁃regulated in human dermal papilla cells treated by 10 and 100 μmol/L adenosine compared with the control group（F=942.630,148.544,respectively,bothP＜ 0.05）.ConclusionAdenosine can promote the growth of human hair follicles and proliferation of dermal papilla cells,likely by up⁃regulating angiogenin expression.

Adenosine;Angiogenins;Hair follicle;Cell proliferation;Cell cycle;Dermal papilla cells

周乃慧，Email：zhounaihui@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.12.003

江苏省自然科学基金（BK20140294、BK20130267）

Fund program:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20140294,BK20130267）

2016⁃03⁃14）

（本文编辑：尚淑贤）