DEK 蛋白在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理的关系

粟连秀，张兆明，陆惠军，韦翠容

（广西医科大学第八附属医院，广西贵港537100）

DEK 蛋白在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理的关系

粟连秀，张兆明，陆惠军，韦翠容

（广西医科大学第八附属医院，广西贵港537100）

目的探讨DEK蛋白在结直肠癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法应用组织芯片和快捷免疫组织化学MaxVisionTM法检测185例结直肠癌及癌旁正常黏膜组织中DEK蛋白表达情况。结果DEK蛋白在结直肠癌中的表达阳性率为86.49%（160/185），明显高于正常结肠黏膜组织［64.86%（120/185）］，差异有统计学意义（P＜0.001）。DEK蛋白表达与肿瘤临床分期及浸润深度有关，临床分期越晚、肿瘤浸润越深，DEK蛋白表达越高，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论DEK蛋白在结直肠癌的发生、发展中起着重要作用。

结直肠肿瘤；免疫组织化学；DEK；组织芯片

结直肠癌是消化系统疾病中常见的恶性肿瘤之一。由于全球人口老龄化及物质生活水平不断改善，结直肠癌发病率及死亡率在全球呈不断上升趋势，已列入常见十大恶性肿瘤之一。随着分子生物学的快速发展及对肿瘤发病机制研究的不断深入，逐渐认识到结直肠癌的发生、发展与多种因素有关，肿瘤相关基因与肿瘤的关系逐渐被阐明。DEK蛋白是原癌蛋白的一种，很多种恶性肿瘤和一部分自身免疫性疾病的发生、发展均与DEK蛋白存在有关，另外，DEK蛋白的功能还有抑制细胞衰老、凋亡，影响细胞增殖和分化。本研究选择组织芯片联合免疫组织化学MaxVisionTM的方法对结直肠癌组织及癌旁正常黏膜组织进行检测，分析DEK蛋白表达水平，通过检测结直肠癌中DEK蛋白表达情况，探讨DEK蛋白表达与结直肠癌发生、发展及各临床病理特征的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料选取本院2010年1月至2012年10月收治的结直肠癌患者185例，均行手术切除。其中男99例，女86例；年龄28～89岁，平均（58.36±1.34）岁；结肠癌101例，直肠癌84例；按照美国癌症联合会（AJCC）公布的标准分期：Ⅰ期47例，Ⅱ期61例，Ⅲ期67例，Ⅳ期10例；肿瘤分化程度：高分化腺癌43例，中分化腺癌88例，低分化腺癌54例；伴淋巴结转移71例，无淋巴结转移114例。185例患者均经病理检查确诊，术前均未曾行放、化疗。185例结直肠癌组织作为研究对象；同时选择距肿瘤边缘5 cm以上的癌旁正常黏膜组织作为对照。

1.2试剂英国Abcam公司生产的兔多克隆抗体DEK（ab85407）、福州迈新生物技术公司生产的抗体稀释液、即用型快捷免疫组织化学MaxVisionTM试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色剂等。

1.3方法

1.3.1组织芯片制备组织芯片采用自制的方法。

1.3.1.1空白受体蜡块制作空白受体蜡块数张备用。

1.3.1.2制备组织芯片蜡块（1）标记目标组织，组织芯片的供体蜡块先行常规病理切片，并经常规苏木精-伊红（HE）染色，病理诊断阅片，然后根据组织切片结果，对相应供体蜡块进行目标组织标记；（2）对组织芯片蜡芯的取样，预热蜡块使其软化，用穿刺针对目标组织进行抽取，将抽取的目标组织分别按预先指定位置放进空白受体蜡块模中；（3）组织芯片蜡块行二次包埋，在蜡模成型框上放入已经取样组织芯片蜡块，把熔化的石蜡液倒入包埋盒，室温冷却至石蜡凝固；（4）把蜡模成型框和塑料石蜡包埋盒周围残留的石蜡去除，并将成型组织芯片蜡块取出。

1.3.1.3组织芯片切片采用全自动组织切片机进行常规病理切片，制备石蜡组织芯片切片，各切片厚度约4 μm。

1.3.2免疫组织化学染色选用快捷免疫组织化学MaxVisionTM法进行免疫组织化学染色。严格按照产品说明书的要求操作，具体染色步骤：（1）先将石蜡组织芯片切片行脱蜡和水化，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.4）冲洗，每次3 min，共3次；（2）高温、高压抗原修复；（3）使用3%过氧化氢溶液（H2O2）在室温下孵育10min，使内源性过氧化物酶的活性被阻断；给予PBS冲洗，每次3min，共3次，去除PBS液；（4）将DEK一抗工作液（1∶800）分别滴入切片，置于4℃冰箱中过夜；（5）用PBS冲洗，每次5 min，共3次，去除PBS液；各张切片加入即用型快捷免疫组织化学MaxVisionTM试剂，继续室温孵育15 min；PBS冲洗，每次3 min，共3次；（6）去除PBS液，每张切片滴加新鲜配制的DAB溶液，在显微镜下连续观察5min；（7）使用流动自来水冲洗，HE复染，用自来水冲洗后返蓝，梯度乙醇脱水使其干燥，再用中性树胶封固；选用已知DEK阳性的组织切片作为阳性对照，而以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4结果判断标准DEK蛋白免疫染色阳性物质呈棕黄色颗粒，细胞核着色；染色评分方法：根据切片中染色强度深浅程度和阳性表达的细胞数比例情况，按照Mathew等［1］的分级标准：切片中无表达为（-）；切片中着色细胞数小于50%或切片中染色较浅为（+）；切片中着色细胞数大于50%且染色较深为（++）。其中（+）和（++）均视为表达阳性。

1.5统计学处理应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1DEK蛋白在癌旁正常黏膜组织与结直肠癌组织中的表达情况DEK蛋白在癌旁正常黏膜组织和结直肠癌组织中的表达阳性率分别为64.86%（120/185）、86.49%（160/185），且二者比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。见表1，图1、2。

表1　DEK蛋白在癌旁正常黏膜组织及结直肠癌组织中的表达情况

图1　DEK蛋白在正常肠黏膜组织中阴性表达情况（快捷免疫组织化学MaxVisionTM法，200×）

图2　DEK蛋白在结直肠癌组织中强阳性表达情况（快捷免疫组织化学MaxVisionTM法，200×）

2.2DEK蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系

DEK蛋白在结直肠癌组织中表达与患者性别、年龄、分化程度等无关（P＞0.05），与肿瘤组织浸润深度、临床分期有关（P＜0.05）。见表2。

表2　DEK蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系（n=185）

续表2　DEK蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的关系（n）

3　讨论

组织芯片技术是在一张固相载体上，集中数十个至数千个不同个体组织标本，形成组织微阵列［2］。组织芯片技术优点是可以进行大样本检测，从而节省时间、人力，还可节省试剂及组织标本等，在当今医学研究领域中得到了广泛应用。

DEK蛋白是一种可磷酸化的具有染色质架构蛋白，其由375个氨基酸组成，属于原癌基因；DEK蛋白主要位于细胞核内。于多细胞生物体中及除酵母外的一些单核细胞有机体中，普遍存在DEK蛋白。DEK在DNA有2个结合域，二者结合特性不同，对CK2磷酸化反应能力也不同［3］。DEK蛋白的生物学作用主要是通过干扰细胞分裂、影响DNA修复［4］，具有抑制细胞分化、衰老及凋亡等作用［5-7］。在多种恶性肿瘤中，DEK蛋白过度表达。乔炜等［8］研究发现，在正常胃组织、慢性萎缩性胃炎组织及胃癌组织中，DEK蛋白表达阳性率不同，分别为28.6%（14/49）、60.3%（38/63）、78.0%（103/132），三者两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；同时肿瘤分化程度及有无淋巴结转移均会影响DEK蛋白在胃癌组织中的表达，表明在胃癌的发生、发展中，DEK蛋白起着重要的促进作用。Lee等［9］研究还发现，DEK蛋白对宫颈癌细胞凋亡具有拮抗功能，在转录调节及和HAT相关的凋亡过程中均起作用，并且DEK蛋白还是高危型HPVE7基因调控下的主要下游靶基因，因此推测HPVE7基因表达因受DEK蛋白的影响，从而引起宫颈癌的发生。张坤等［10］研究结果显示，DEK蛋白在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.01）；同时运用Log-rank及Cox风险回归模型，通过结直肠癌患者生存时间与DEK蛋白表达的相关性分析，以及DEK蛋白表达对患者生存因素的影响发现，在结直肠癌患者中DEK蛋白高表达者总生存时间明显低于DEK蛋

Relationship between DEK protein expression in colorectal cancer tissue and clinicopathology

Su Lianxiu，Zhang Zhaoming，Lu Huijun，Wei Cuirong（Eighth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Guigang，Guangxi 537100，China）

ObjectiveTo investigate the expression of DEK protein in colorectal cancer and its relationships with clinicopathological features.MethodsThe expression of DEK protein was detected in 185 cases of colorectal cancer tissues and paracancerous normal mucosa tissues by using the tissue microarray and immunohistochemical MaxVisionTM method.Results The positive expression rate of DEK protein in colorectal cancer was 86.49%（160/185），which was significantly higher than 64.86%（120/185）in the normal colonic mucosa tissues，the difference was statistically significant（P＜0.001）.The DEK protein expression was related to the tumor clinical stage and infiltration degree.The later the tumor clinical stage，the deeper the tumor infiltration，the higher the DEK protein expression，the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionDEK protein plays an important role in the occurrence and development of colorectal cancer.

Colorectal tomur；Immunohistochemistry；DEK；Tissue microarray

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.19.005

A

1009-5519（2016）19-2951-03

粟连秀（1970-），在职硕士研究生，副主任医师，主要从事胃肠肿瘤病理的研究。