玉米AGO基因在籽粒发育过程中的表达分析

张　丹，王　玲，刘　晓，阚云超，李丹丹

(南阳师范学院 河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，河南南阳 473061)



玉米AGO基因在籽粒发育过程中的表达分析

张丹，王玲，刘晓，阚云超，李丹丹*

(南阳师范学院 河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，河南南阳 473061)

以玉米自交系‘昌7-2’授粉后4个时间点(授粉后7、10、14和20 d)的籽粒总RNA为研究对象，采用实时荧光定量PCR技术，对玉米中5个Argonaute(AGO)蛋白家族基因(AGO1、AGO2、AGO4、AGO10和AGO18)在籽粒不同发育时期的表达谱进行了研究。结果表明：AGO1和AGO2在籽粒发育过程中呈现一致的表达趋势，在授粉后7 d的籽粒中表达量最高，从授粉后7 d到20 d呈持续下降的趋势。AGO4、AGO10和AGO18具有一致的表达趋势，均呈现先下降后上升的趋势，在授粉后10 d的籽粒中表达量最低。结合实验室前期获得的miRNA在玉米籽粒不同发育阶段的表达谱，发现不同AGO家族基因可协助其靶标miRNA参与玉米籽粒发育调控。

玉米；籽粒；AGO基因；表达谱

miRNA可参与生物的生长、分化、增殖和胁迫反应等一系列生物学过程[1]。miRNA和Argonaute(AGO)蛋白家族形成RNA-induced silencing complex(RISC)，从而调节序列特异性靶基因沉默或翻译抑制[2-3]。AGO蛋白是RISC的功能核心，具有高度保守性。AGO蛋白由N末端、PAZ、MID和PIWI 4个结构域组成。PAZ区能非序列特异性识别结合双链小RNA 3′端2个核苷酸，MID与PIWI界面处的“保守口袋”识别结合小RNA 5′端第一位核苷酸，PIWI区具有切割mRNA的催化中心[4]。植物中AGO蛋白和miRNA共同参与维持基因组的稳定、调控组织发育、响应逆境适应性应答、在RNA层面对入侵核酸(转基因质粒和植物病毒)的免疫、对靶mRNA进行切割或翻译水平的抑制，以及在转录或转录后水平上控制转座元件的移动等[5-7]。目前，在拟南芥中发现AGO蛋白10个[8]，大豆中发现22个[9]，水稻中19个[10]，玉米中18个[11-12]。所有的开花植物的AGO蛋白家族可以归为3个大类：AGO1/5/10家族、AGO2/3/7家族和AGO4/6/8/9家族，AGO18是与AGO1/5/10 大类亲缘关系较近的一个分支[8,13]。

在拟南芥中，AGO1主要参与植物的生长发育调控和胁迫反应[14]，AGO2参与植物的抗菌和病毒防御活动[15]，AGO4调控RNA介导DNA甲基化信号通路以及与内源的siRNAs结合导致基因沉默[16]，AGO5调控雌配子体发生和RNA沉默[17]，AGO6参与调控tasiRNA的甲基化、转座子的转录活性和分生组织的根除[18]，AGO7主要参与植物叶的发育以及维持分生组织以及植物从幼嫩到成熟生长阶段的过渡[19]，AGO9和韧皮部生殖细胞的分化抑制和DNA修复有关[6]，AGO10调控植物的顶端分生组织[20]。玉米18个AGO家族蛋白可归属在5个大类中，AGO1、MEL1/AGO5、ZIPPY/AGO7、AGO4和AGO18[11]。AGO9归在AGO4家族中，参与生殖细胞中体壁细胞的分化[21]，AGO18参与生殖细胞的发展[12]。

玉米是世界上重要的粮食作物和饲料作物，目前在miRbase数据库中收录的玉米成熟miRNA序列有321条，它们参与到玉米的新陈代谢的各个过程中[22-28]。对miRNA功能的解析离不开对AGO基因功能的探索。但是目前关于玉米AGO基因的表达谱及功能研究并不多。因此，我们在前期对玉米籽粒发育过程的miRNA深入研究的基础上[29]，选取河南省普遍种植的玉米自交系‘昌7-2’为研究对象，选取5个AGO蛋白大类中的代表性AGO基因(AGO1、AGO2、AGO4、AGO10和AGO18)，研究其在玉米授粉后不同天数(7、10、14和20 d)的表达谱，为探索AGO基因和miRNA协同调控玉米籽粒的形成机制奠定基础。

1　材料和方法

1.1材料

以河南农业大学农学院提供的玉米自交系‘昌7-2’为试验材料，分别取授粉后7、10、14和20 d的籽粒，置于液氮中研磨，TRIzol(ThermoFisher Scientific)法提取总RNA。

表1　Real-time PCR所用引物Table 1　Primer sets for real-time PCR

1.2方法

1.2.1AGO基因的克隆与测序取玉米籽粒总RNA 2 μg，使用反转录试剂盒(Takara)进行cDNA的合成。利用表1所列引物及高保真酶扩增6个AGO基因。PCR产物采用DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)回收，将回收的目的片段连接PMD-19 T easy载体(Takara)，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，送北京奥科鼎盛生物技术有限公司进行测序，测序结果用DNAMAN进行序列比对。

1.2.2实时荧光定量PCR (Real-time PCR)取玉米授粉后不同时期籽粒的总RNA 2 μg，使用反转录试剂盒(Takara)进行cDNA的合成。采用FastStart Universal SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(Roche)进行Real-time PCR。PCR 反应条件为：95 ℃ 变性15 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40个循环。PCR引物如表1所示，tubulin为内参基因，灭菌双蒸水模板为阴性对照。PCR结果采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

2　结果与分析

选择玉米自交系‘昌7-2’授粉后7、10、14和20 d的籽粒为研究对象，利用TRIzol法提取总RNA，通过琼脂糖凝胶检测RNA质量(图1)。结果显示，所提RNA无基因组污染，28S和18S条带清晰，OD260/OD280在1.8～2.0之间，表明RNA完整，蛋白污染较少，可用于后续实验。

利用玉米B73基因组数据库中得到的5个AGO基因序列设计引物，通过高保真酶在玉米自交系‘昌7-2’中扩增相应的AGO基因，得到AGO1、AGO2、AGO4、AGO10和AGO18均有单一的扩增产物，且无引物二聚体污染(图2)，通过测序鉴定发现，‘昌7-2’中扩增到的AGO2和AGO10基因片段与B73中对应的基因序列完全相同，AGO4和AGO18与B73仅差别1个碱基，AGO1扩到的为AGO1a-like基因AC199001.3_FG005，与AGO1一致性为88.8%，与B73中对应的基因差别仅1个碱基(图3)。表明在‘昌7-2’中扩增的为真实的AGO家族目的基因。

为了获得AGO基因在玉米授粉后籽粒中的表达谱，选取授粉后7、10、14和20 d的籽粒总RNA为研究对象，采用实时荧光定量PCR方法检测不同AGO基因在籽粒发育过程中的表达水平。结果如图4所示，AGO1、AGO2、AGO4、AGO10和AGO18在玉米籽粒形成过程中均有表达。AGO1和AGO2在籽粒发育过程中呈现一致的表达趋势，在授粉后7 d的籽粒中表达量最高，从授粉后7 d到20 d呈持续下降的趋势。AGO4、AGO10和AGO18存在一致的表达趋势，均呈现先下降后上升的趋势，在授粉后10 d的籽粒中表达量最低。AGO4和AGO18在授粉后7 d的籽粒中表达量最高，到10 d降至最低，随后逐渐上升。而AGO10在授粉后7 d的籽粒中表达量与14 d基本持平，10 d时最低，在籽粒发育后期，至20 d时表达量最高。表明不同的AGO基因可能在玉米籽粒发育的不同阶段发挥作用。

M.DL2000；1～4分别为授粉后7、10、14和20 d的玉米籽粒RNA图1　不同发育时间点玉米籽粒RNA电泳结果M. DL2000；1-4 represented RNAs of 7,10,14 and 20 dFig. 1　RNAs being extracted from different developmental stages of maize seed after pollination

M.DL2000；1～6分别为AGO1、AGO2、AGO4、AGO10、AGO18和tubulin图2　5个AGO基因RT-PCR扩增结果M. DL2000；1-6 represented the amplification results of AGO1,AGO2,AGO4,AGO10,AGO18 and tubulinFig. 2　RT-PCR results of amplification of five AGO genes

图3　昌7-2和B73中AGO1(A)、AGO4(B)、AGO18(C)基因比对结果Fig. 3　Alignment results of AGO1(A),AGO4(B),AGO18(C)between Chang 7-2 and B73

图4　AGO家族基因在玉米授粉后不同天数籽粒中的相对表达量Fig. 4　The relative expression of AGO genes in different developmental stages of maize seed after pollination

3　讨　论

在RISC中，miRNA作为向导引导AGO蛋白在特定的部位发挥相应的功能，AGO蛋白是RISC的核心元件[30]。本研究以河南省推广种植的玉米自交系‘昌7-2’为研究对象，首次探索了玉米授粉后(7、10、14和20 d)不同时间点AGO基因的表达谱。结果显示：AGO1和AGO2在授粉后7 d的籽粒中表达量最高，随后呈持续下降的趋势。而AGO4、AGO10和AGO18则呈现先下降后上升的趋势，在授粉后10 d的籽粒中表达量最低。表明这些不同的AGO基因可能在玉米籽粒形成的不同阶段发挥各自特殊的功能。

在籽粒发育早期主要进行细胞分裂、胚胎发生和组织器官形成等活动，该阶段高表达的miRNA主要为miR159、miR165/166等家族[29,31]，而AGO1可通过扣押miR165/166，促进miRNA miR165/166靶基因Class Ⅲ homeodomain-leucine zipper(HD-ZIP Ⅲ)转录因子的表达，HD-ZIP Ⅲ家族基因在茎顶端分生组织建立、维管发育和侧生器官的极性形成过程中发挥重要作用，突变HD-ZIP Ⅲ家族基因将造成单针形子叶的形成[32-33]。玉米AGO1在授粉后7 d的籽粒中高表达，随后持续下降，这与其负向调控的miR165/166家族的表达趋势是相符的，表明在籽粒发育早期的胚胎形成过程中，AGO1可通过miR165/166等小分子RNA发挥调控作用。与AGO1同家族的AGO10，可作为miR166/165的诱饵，阻止miR166/165进入AGO1复合体，从而抑制HD-ZIP Ⅲ转录因子的表达[34]。拟南芥中研究也表明，AtZLL/AtAGO10在顶端分生组织的维持过程中发挥作用[35-36]。AGO10基因在玉米籽粒发育早期组织器官形成过程的低表达和营养物质积累时期的高表达，可能与其功能的发挥密切相关。

玉米授粉后10～15 d为籽粒从细胞分裂和组织器官形成到营养物质积累的过渡阶段，AGO4和AGO18均在授粉后10 d的籽粒中表达量最低，随后在籽粒营养物质积累过程中持续升高。拟南芥中AtAGO4主要作用于siRNA，发挥表观遗传沉默作用[37-38]。而AGO18只存在于草本植物中，在植物繁殖生长和病毒防御过程中发挥作用[12]，玉米AGO18有两个转录本，其中的一个ZmAGO18b在雄性减数分裂期间绒毡层和生殖细胞富集，这与24-nt phasiRNA表达趋势一致，因此预测玉米ZmAGO18b可能结合24-nt phasiRNAs发挥作用[39]，AGO4和AGO18在籽粒发育过渡期的低表达及营养物质累积期的高表达可能与其功能的实现密切相关。本结果为深入探索不同的AGO基因对玉米籽粒发育的作用机制奠定了良好的基础。

[1]IWAKAWA H，TOMARI Y.The functions of MicroRNAs：mRNA decay and translational repression[J].TrendsinCellBiology，2015，25(11)：651-665.

[2]KOBAYASHI H，TOMARI Y.RISC assembly：Coordination between small RNAs and Argonaute proteins[J].BiochimicaetBiophysicaActa，2016，1 859(1)：71-81.

[3]ARIYOSHI J，MOMOKAWA D，EIMORI N，etal.Development of novel antisense oligonucleotides for the functional regulation of RNA-Induced Silencing Complex (RISC) by promoting The release of microRNA from RISC[J].BioconjugateChemistry，2015，26(12)：2 454-2 460.

[4]HUTVAGNER G，SIMARD M J.Argonaute proteins：key players in RNA silencing[J].NatureReviewsMolecularCellBiology，2008，9(1)：22-32.

[5]MEISTER G.Argonaute proteins: functional insights and emerging roles[J].NatureReviewsGenetics，2013，14(7)：447-459.

[6]OLIVER C，SANTOS J L，PRADILLO M.On the role of some ARGONAUTE proteins in meiosis and DNA repair inArabidopsisthaliana[J].FrontiersinPlantScience，2014，5：177.

[7]ZHAI J，ZHAO Y，SIMON S A，etal.Plant microRNAs display differential 3′truncation and tailing modifications that are ARGONAUTE1 dependent and conserved across species[J].PlantCell，2013，25(7) ：2 417-2 428.

[8]VAUCHERET H.Plant ARGONAUTES[J].TrendsinPlantScience，2008，13(7)：350-358.

[9]LIU X，LU T，etal.Identification of RNA silencing components in soybean and sorghum[J].BMCBioinformatics，2014，15：4.

[10]KAPOOR M，ARORA R，LAMA T，etal.Genome-wide identification， organization and phylogenetic analysis of Dicer-like，Argonaute and RNA-dependent RNA Polymerase gene families and their expression analysis during reproductive development and stress in rice[J].BMCGenomics，2008，9：451.

[11]QIAN Y，CHENG Y，CHENG X，etal.Identification and characterization of Dicer-like，Argonaute and RNA-dependent RNA polymerase gene families in maize[J].PlantCellReports，2011，30(7)：1 347-1 363.

[12]ZHAI L，SUN W，ZHANG K，etal.Identification and characterization of Argonaute gene family and meiosis-enriched Argonaute during sporogenesis in maize[J].JournalofIntegrativePlantBiology，2014，56(11)：1 042-1 052.

[13]ZHANG H，XIA R，MEYERS B C，etal.Evolution，functions，and mysteries of plant ARGONAUTE proteins[J].CurrentOpinioninPlantBiology，2015，27：84-90.

[14]VAUCHERET H， VAZQUEZ F， CRÉTÉ P，etal.The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development[J].Genes&Development，2004，18(10)：1 187-1 197.

[15]JAUBERT M，BHATTACHARJEE S，MELLO A F，etal.RGONAUTE2 mediates RNA-silencing antiviral defenses against potato virus X inArabidopsis[J].PlantPhysiology，2011，156(3)：1 556-1 564.

[16]HAVECKER E R，WALLBRIDGE L M，etal.TheArabidopsisRNA-directed DNA methylation argonautes functionally diverge based on their expression and interaction with target loci[J].PlantCell，2010，22(2)：321-334.

[17]BROSSEAU C，MOFFETT P.Functional and genetic analysis identify a role for arabidopsis ARGONAUTE5 in antiviral RNA silencing[J].PlantCell，2015，27(6)：1 742-1 754.

[18]MCCUE A D，PANDA K，etal. ARGONAUTE 6 bridges transposable element mRNA-derived siRNAs to the establishment of DNA methylation[J].TheEMBOJournal，2015，34(1)：20-35.

[19]HUNTER C，SUN H，POETHIG R S，etal. TheArabidopsisheterochronic gene ZIPPY is an ARGONAUTE family member[J].CurrentBiology，2003，13(19)：1 734-1 739.

[20]JI L，LIU X，YAN J，etal. ARGONAUTE10 and ARGONAUTE1 regulate the termination of floral stem cells through two microRNAs inArabidopsis[J].PLoSGenetics，2011，7(3)：e1001358.

[21]SINGH M，GOEL S，MEELEY R B，etal. Production of viable gametes without meiosis in maize deficient for an ARGONAUTE protein[J].PlantCell，2011，23(2)：443-458.

[22]ZHANG B，PAN X，ANDERSON T A.Identification of 188 conserved maize microRNAs and their targets[J].FEBSLetters，2006，580(15)：3 753-3 762.

[23]ZHANG L，CHIA J M，KUMARI S，etal.A genome-wide characterization of microRNA genes in maize[J].PLoSGenetics，2009，5(11)：e1000716.

[24]KANG M，ZHAO Q，ZHU D，etal.Characterization of microRNAs expression during maize seed development[J].BMCGenomics，2012，13：360.

[25]LIU P，YAN K，etal.Transcript profiling of microRNAs during the early development of the maize brace root via Solexa sequencing[J].Genomics，2013，101(2)：149-156.

[26]DING D，LI W，HAN M，etal.Identification and characterisation of maize microRNAs involved in developing ears[J].PlantBiology，2014，16(1)：9-15.

[27]LI X M，SANG Y L，ZHAO X Y，etal.High-throughput sequencing of small RNAs from pollen and silk and characterization of miRNAs as candidate factors involved in pollen-silk interactions inmaize[J].2013，PLoSOne，8(8)：e72852.

[28]GU Y，LIU Y，ZHANG J，etal.Identification and characterization of microRNAs in the developing maize endosperm[J].Genomics，2013，102(5-6)：472-478.

[29]LI D，LIU Z，GAO L，etal.Genome-wide identification and characterization of microRNAs in developing grains ofZeamaysL.[J].PLoSOne，2016，11(4)：e0153168.

[31]LIU X，FU J，GU D，etal.Genome-wide analysis of gene expression profiles during the kernel development of maize (ZeamaysL.)[J].Genomics，2008，91(4)：378-387.

[32]PRIGGE M J，OTSUGA D，ALONSO J M，etal.Class III homeodomain-leucine zipper gene family members have overlapping, antagonistic, and distinct roles inArabidopsisdevelopment[J].PlantCell，2005，17(1)：61-76.

[33]TALBERT P B，ADLER H T，etal.The REVOLUTA gene is necessary for apical meristem development and for limiting cell divisions in the leaves and stems ofArabidopsisthaliana[J].Development，1995，121(9)：2 723-2 735.

[34]ZHU H，HU F，WANG R，etal.ArabidopsisArgonaute10 specifically sequesters miR166/165 to regulate shoot apical meristem development[J].Cell，2011，145(2)：242-256.

[35]MOUSSIAN B，SCHOOF H，HAECKER A，etal.Role of the ZWILLE gene in the regulation of central shoot meristem cell fate during Arabidopsis embryogenesis[J].EMBOJournal，1998，17(6)：1 799-1 809.

[36]LYNN K，FERNANDEZ A，AIDA M，etal.The PINHEAD/ZWILLE gene acts pleiotropically inArabidopsisdevelopment and has overlapping functions with the ARGONAUTE1 gene[J].Development，1999，126(3)：469-481.

[37]ZILBERMAN D，CAO X，JACOBSEN S E.ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation[J].Science，2003，299(5 607)：716-719.

[38]ZILBERMAN D，CAO X，etal.Role ofArabidopsisARGONAUTE4 in RNA-directed DNA methylation triggered by inverted repeats[J].CurrentBiology，2004，14(13)：1 214-1 220.

[39]ZHAI J，ZHANG H，etal.Spatiotemporally dynamic, cell-type-dependent premeiotic and meiotic phasiRNAs in maize anthers[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2015，112(10)：3 146-3 151.

(编辑:宋亚珍)

Cloning and Expression Analysis ofAGOGenes during Maize Seed Development

ZHANG Dan，WANG Ling，LIU Xiao，KAN Yunchao，LI Dandan*

(Henan Key Laboratory of Insect Biology in Funiu Mountain，Nanyang Normal University, Nanyang Henan 473061，China)

The expression profiles of 5AGOgenes(AGO1，AGO2，AGO4，AGO10 andAGO18)in different developmental stages of maize seed(ZeamaysL.inbred line，‘Chang 7-2’)after pollination were analyzed by the method of real-time quantitative PCR.Results showed that, the expression pattern ofAGO1 andAGO2 were similar during maize seed development, showing a decline trend from the 7thday after pollination (DAP) to the 20thDAP, with much more accumulation at the 7thDAP.The expression pattern ofAGO4,AGO10 andAGO18 were similar, with a trend of being decreased first then increased, with the lowest expression at the 10thDAP.With our previous results of expression pattern of miRNAs during maize seed development, we found that differentAGOgene families together with their target miRNAs, can involved in the regulation of maize seed development.

ZeamaysL.；seed；AGOgene；expression pattern

1000-4025(2016)09-1752-05doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1752

2016-05-03;修改稿收到日期:2016-07-06

河南省科技厅农业重点攻关项目(112102110158)

张 丹(1990-)，女，在读硕士研究生，主要从事植物与昆虫互作研究。E-mail：15514180175@163.com

李丹丹，博士，副教授，主要从事植物与昆虫互作研究。E-mail：lidannytc@126.com

Q789; Q946

A