枸杞WRKY3基因克隆及组织表达分析

徐惠娟，郑　蕊，陈　任，王彦才，王丽娟

(宁夏大学 生命科学学院，西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川750021)



枸杞WRKY3基因克隆及组织表达分析

徐惠娟，郑蕊，陈任，王彦才，王丽娟*

(宁夏大学 生命科学学院，西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川750021)

以枸杞为材料， 采用PCR及RACE方法，克隆了枸杞WRKY转录因子基因 cDNA序列，命名为LbWRKY3，GenBank登录号为 KX196192。 在生物信息学分析的基础上，进行亚细胞定位、基因表达分析。结果显示：(1)LbWRKY3开放阅读框ORF长度为1 068 bp， 编码356个氨基酸。(2)生物信息学分析显示，LbWRKY3编码蛋白具有一个WRKY结构域，二级结构中不规则卷曲结构所占比例最大(58.67%)，延伸链结构次之(18.88%)，α螺旋比例为15.82%，β转角最少，仅为 6.63%； Lb WRKY3蛋白与案头菊WRKY蛋白、黄花蒿WRKY蛋白相似性较高。(3) 亚细胞定位显示，Lb WRKY3蛋白定位于细胞核。 (4)实时定量PCR分析表明，LbWRKY3在根中表达量最高，在花中表达量最低； 在枸杞果实发育过程中LbWRKY3均有表达，表达量随果实成熟逐渐升高，并于35 d达到峰值；LbWRKY3基因在果实中的表达具有组织特异性表达特性(果肉>果皮>种子)。研究表明，LbWRKY3基因参与了枸杞果实生长发育调控。

枸杞；WRKY转录因子；果实发育；表达模式

WRKY 转录因子是近年来在植物中发现的一类重要转录因子，在拟南芥中有75个成员，水稻中有109个成员，由于其N-末端含有高度保守的WRKYGQK 氨基酸序列而得名。1994年Ishiguro和Nakamura在甘薯中发现了第一个WRKY转录因子SPF1， 随后其他研究者又相继在野燕麦、欧芹、拟南芥、番茄、棉花、烟草、辣椒等多种植物[1-2]中发现该类转录因子。

WRKY是一种诱导型调节因子，N-端含有7个绝对保守的氨基酸序列(WRKYGQK)及锌指结构(CX4-7CX22-23HXH/C)，能够通过与核心序列为 (T)(T)TGAC(T/C)的W-box 顺式元件特异结合而调节基因的表达。根据WRKY转录因子结构域的数量和锌指结构的类型可分为3类。其中第Ⅰ类与第Ⅱ类都含有相同的锌指结构C2H2。第Ⅰ类含2个WRKY结构域，如最早识别的WRKY蛋白IbSPF1、CsSE71[3]等。第Ⅱ类只含有1个WRKY结构域，包括了大多数的WRKY转录因子。 第Ⅲ类也只含有1个WRKY结构域，但其锌指结构为C2HC型，这类转录因子只存在于高等植物中。

最初的研究认为，WRKY基因参与植物糖信号途径的建立和染色质重塑[4]。随后研究表明，WRKY基因在植物生长发育和各种生理过程中均起到重要的调节作用，包括胚胎发育、种皮和毛状体发育以及植物衰老，生物合成调节和信号转导途径等。此外，各种生物胁迫与非生物胁迫亦能诱导WRKY转录因子表达，使其广泛参与植物的各种胁迫应答[5]。

枸杞(LyciumbarbarumL.)属茄科，多年生落叶小灌木 (2n=24)。其果实被称为枸杞子(Fructuslycii)，枣核大小，色泽鲜红，味道甜美，果肉柔润，是中国传统名贵中药材，具有补肾养肝、润肺明目之功效。糖是枸杞果实的重要组分，其种类、含量直接影响着枸杞果实的药用价值、风味口感、色泽等品质性状。枸杞果实发育的过程中，糖的含量和组成不断变化，尤其蔗糖、葡萄糖和果糖对果实品质形成起重要作用[6-7]。WRKY转录因子是调控果实发育的重要转录因子，然而其对枸杞果实的调控研究尚未见报道。本研究以‘宁杞1号’为研究材料，分离WRKY类转录因子，并对其进行序列和表达分析，为揭示枸杞品质形成的分子调控机制积累研究资料，为提高枸杞果实的产量和质量提供一些新的切入点。

1　材料与方法

1.1材料

供试材料为5年生‘宁杞1号’枸杞，种植于宁夏农林科学院园艺研究所实验田，常规栽培管理。于2015年8月，果实材料的收集参照王丽娟等[8]的方法，同时采集成熟根、成熟茎、成熟叶、成熟花，不同的器官均重复 3 次，取样后于液氮中速冻后，置-80 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1RNA提取和反转录按照植物总RNA 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)说明书要求，分别取0.01 g枸杞根、茎、叶、花、果实提取总RNA， 取0.8 μg总RNA ，按照RNA反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)说明，将提取RNA反转录成 cDNA。

1.2.2LbWRKY3基因全长的克隆利用Dnaman 6.0软件分析已知物种WRKY基因的核苷酸序列， 在保守区域设计引物。正向引物FF-LbWRKY3(5′-CACAGTTGGAGAAAGTATGGAC-3′)，反向引物 RF-LbWRKY3(5′-AAAGGTGGCGAATAGACTTGC-3′)，以逆转录果实cDNA 为模板扩增枸杞WRKY基因保守片段。反应条件为94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s； 58 ℃ 30 s； 72 ℃ 40 s。30 个循环后72 ℃ 10 min。回收目的片段，连接到pGM-T Easy载体上，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经菌落 PCR 检测后，随机选取3个独立的阳性克隆进行测序 (上海生工生物工程技术服务有限公司)。

根据基因特异引物PCR扩增得到的同源保守序列，依据RACE操作手册分别设计3′-RACE、5′-RACE引物(表1)，并按要求逆转录生成 cDNA 第一链。两轮程序分别为：(1)94 ℃ 30 s，71 ℃ 2.5 min，重复 6 个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 40 s，73 ℃ 3 min，重复 6 个循环；94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，73 ℃ 2 min，25 个循环；(2)95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30 个循环，73 ℃ 5min。分别对 PCR 扩增条带检测、回收和测序。依据测序结果，设计1对全长引物，扩增LbWRKY3的 ORF 阅读框，引物分别为 F-LbWRKY3和R-LbWRKY3(表1)。

1.2.3编码蛋白的生物信息相关分析Lb WRKY3编码蛋白理化相关性质的分析采用 Protparam 工具 (http://web.expasy.org/protparam/)；采用SOMPA(http://www.expasy.ch/tools)和 Phyre2 在线软件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/)分别对 Lb WRKY3编码蛋白进行二级结构与三维结构分析；分泌蛋白和蛋白定位信号预测分析分别使用 SignalP4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和 ProtComp v. 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)。通过NCBI 搜索下载 Lb WRKY3氨基酸同源序列，通过DNAMAN软件构建系统进化树。

1.2.4亚细胞定位(1) 载体构建利用得到的枸杞LbWRKY3全长ORF序列，通过引物引入2个酶切位点BamH I 和KpnI，并将扩增片段连入pMD19-T载体。经过蓝白斑筛选，对阳性克隆进行测序验证。 提取正确T载体克隆的质粒，双酶切得到目标基因片段，构建pCAMBIA1301-GFP 载体，将GFP与Lb WRKY3蛋白C端融合，得到Lb WRKY3-GFP 融合蛋白，并通过35S启动子，增强融合蛋白的表达。该载体用于基因枪洋葱表皮轰击试验。

(2) 基因枪洋葱表皮轰击实验方法利用质粒大抽试剂盒(大连宝生物工程有限公司)提取4 μg pCAMBIA1301-GFP-LbWRKY3质粒。将所得质粒与 50 mg/mL的金粉悬液混合，加入抽滤灭菌的4 μL亚精胺(0.1 mol/L)、 6 μL CaCl2(2.5 mol/L)后混匀，冰上静置15 min，12 000 r/min 离心10 s，清水清洗重复3次，金粉沉淀通过12 000 r/min 离心收集，最后的金粉-质粒混合物通过20 μL无水乙醇重悬。

将洋葱内表皮撕取下来浸入高渗培养液(MS无机盐、40 g/L甘露醇)中，室温下处理4 h；然后转入由MS无机盐+40 g/L甘露醇+0.7% 琼脂组成的高渗固体培养基中备用。同时将基因枪气瓶压力调节为1 300 psi；用 70%乙醇浸润载体膜、可裂膜、阻拦网1 min，自然风干；在微粒载体膜中央添加10 μL 微粒悬浮液，晾干后轰击备用的洋葱表皮；材料在轰击结束后转移到MS培养基中培养24 h；最后用激光共聚焦显微镜(德国Toptica公司)观察GFP的表达，波长设置为488 nm。

1.2.5实时荧光定量PCR以枸杞持家基因LbActin为内参，引物为F-Actin(5′-TCACACTTTCTACAATGAGCT-3′)和 R-Actin(5′-GATATCCACATCACACTTCAT-3′)，分别以稀释50倍的反转录(枸杞根、茎、叶、花、果实)cDNA作为模板，采用real-time PCR检测LbWRKY3基因在枸杞不同器官、不同发育时期果实、果实不同组织的表达量。 采用Primer Primer 5.0设计荧光定量引物。PCR扩增引物为QF-LbWRKY3(5′-ATACCGCAAGGCTGAGAAGT-3′)和QR-LbWRKY3(5′-TGTTGGTGGTGGGTTGTGT-3′)。反应体系为：模板 cDNA 1 μL(10 ng/μL)，上下游引物分别为 0.25 μL，SYBR Premix Ex TaqTM(大连宝生物工程有限公司)10 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环，每个样品3个重复。所用仪器为 ABI 7300 Real-Time PCR 仪(美国ABI公司)，相对表达量的计算采用2-ΔΔCt方法[16]。采用SPSS19 软件对表达量进行显著性分析，每处理重复3次。

表1　引物列表Table 1　Primers used in this study

2　结果分析

2.1枸杞Lb WRKY3克隆

通过比对已知物种中WRKY同源基因保守区域，设计引物以枸杞果实cDNA 为模板进行扩增，得到1条特异条带，长度约为500 bp。测序结果表明，该片段与烟草、番茄、马铃薯等物种的WRKY同源基因具有较高一致性，表明该片段是WRKY在枸杞中的同源基因片段。基于得到的枸杞WRKY同源基因片段，设计4 条特异引物(3′-RACE，5′-RACE)，然后进行RACE克隆。得到扩增产物并测序后，设计cDNA全长引物F- Lb WRKY3和 R- Lb WRKY3， 使用LATaqDNA 聚合酶扩增全长后测序。

分析测序结果，得到了1 068 bp全长cDNA序列(图 1)。其中 4 种碱基含量分别为34.0%(A)、15.7%(G)、30.9%(T)和19.5%(C)。通过NCBI数据库进行检索，分析结果发现该序列属于WRKY转录因子基因家族的基因。将该序列命名为LbWRKY3，GenBank 登录号为KX196192。

下划线部分为WRKY保守结构域；*为终止密码子图1　Lb WRKY3 基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列The WRKY domain is underlined; * means stop code of amino acidsFig. 1　Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Lb WRKY3 in Lycium barbarum

2.2枸杞Lb WRKY3编码蛋白特性分析

通过 DNAMAN 软件分析显示LbWRKY3具有一个完整开放阅读框，编码356个氨基酸, 含有一个WRKY保守域，编码蛋白的分子式为C987H1486N272O309S7，分子量为22.33kD，等电点为5.52，包含带正电残基(Arg+Lys)为20个，带负电残基(Asp + Glu) 为28个。进一步分析得到，该蛋白不稳定系数为 40.57，脂肪系数为 59.74，平均亲水性系数为-0.803。

经 CBS 服务器网站的 NetPhos 2.0(http:// www. Cbs. Dtu. dk/ services/ NetPhos/)对 Lb WRKY3蛋白序列进行磷酸化位点分析发现，该序列上有6个 Ser ，2个Thr和2个Tyr 可能成为蛋白激酶磷酸化位点。Signal P4.0 Server 软件分析发现，Lb WRKY3蛋白不含信号肽，这与ProtComp Version 9.0 软件预测 Lb WRKY3亚细胞定位在细胞核结果相符合。利用 SOPMA 软件分析，发现Lb WRKY3蛋白二级结构中，不规则卷曲结构所占比例最大，为 58.67%；延伸链结构(extended strand)次之 18.88%，α螺旋比例为 15.82%；β转角最少，仅为 6.63%。Lb WRKY3蛋白三维结构见图2。

2.3Lb WRKY3核酸序列比对与进化分析

Blastp蛋白比对发现， Lb WRKY3与案头菊WRKY7、黄花蒿WRKY1、丹参WRKY11、番茄WRKY53、木薯WRKY39蛋白有较高相似度，均含有一个WRKY结构域。

从NCBI非冗余蛋白数据库(Nr)中选取与Lb WRKY3基因编码蛋白相似性较高的12条蛋白序列，采用DNAMAN软件，用其内置Neighbor-joining 法构建进化树。结果表明，枸杞 Lb WRKY3与案头菊WRKY7(KC615361.1) 聚在一起，分子距离最近，其次与黄花蒿WRKY1 (FJ390842.1)、 案头菊WRKY53(KM359566.1)的分子距离也相对较近(图3)。

2.4枸杞Lb WRKY3蛋白亚细胞定位

蛋白序列分析发现Lb WRKY3的N端具有核定位信号肽，经蛋白亚细胞定位ProtComp Version 9.0 软件推测Lb WRKY3位于细胞核内。为验证这一推测，利用洋葱表皮细胞瞬时表达系统对Lb WRKY3进行亚细胞定位研究。构建的植物表达载体pCAMBIA1301-Lb WRKY3-GFP 中，Lb WRKY3的C末端与GFP融合(图4，A)。质粒DNA经测序验证后转入根癌农杆菌中，采用基因枪法转化洋葱表皮细胞。35S CaMV组成型启动子能够启动基因在细胞中表达，可通过显微镜观察报告基因的绿色荧光信号来确定Lb WRKY3在细胞中的分布。结果显示：未与Lb WRKY3融合的35S∶GFP(阴性对照)分布于整个细胞中(图4，A)，而Lb WRKY3∶GFP融合蛋白定位于细胞核中(图4, B)，说明Lb WRKY3是具有细胞核定位功能的蛋白。

图 2　Lb WRKY3 蛋白三维结构预测Fig. 2　Three-dimensional structure of deduced Lb WRKY3 protein

2.5Lb WRKY3的定量表达分析

2.5.1LbWRKY3的器官特异性表达分析利用实时定量PCR法分析LbWRKY3在根、茎、叶、花中的表达情况。结果表明，LbWRKY3在各器官均有表达，但表达量不同，其在根中的表达量最高，在叶和茎中的表达量次之，而在花中的表达量相对最低(图 5)，并且不同器官表达量的差异均达到极显著水平，这表明LbWRKY3的表达具有器官特异性。

图3　枸杞WRKY3与其他物种 WRKY 蛋白的系统进化分析Fig. 3　Phylogenetic evolutionary analyses of WRKY proteins from different plant species

A.阴性对照；B．35S∶GFP∶Lb WRKY3融合蛋白图 4　枸杞WRKY3 蛋白的亚细胞定位结果A. Negative control; B. Fusion protein of 35S∶GFP∶Lb WRKY3Fig. 4　The results of subcellular location of Lb WRKY3 protein

小写字母表示不同器官基因表达差异显著性(P<0.05)图 5　Lb WRKY3 在不同器官中的表达模式分析The letters indicate significant differences in different organs (P<0.05)Fig. 5　Expression pattern analysis of Lb WRKY3 in different organs

小写字母表示枸杞果实不同发育阶段基因表达差异的显著性(P<0.05)图 6　Lb WRKY3 在果实不同发育阶段的表达The letters indicate significant differences in different growth stages of fruit (P<0.05)Fig. 6　Expression pattern of Lb WRKY3 in different growth stages of fruit

小写字母表示果实不同结构基因表达差异的显著性(P<0.05)图 7　Lb WRKY3 在果实的各个结构中表达模式分析The letters indicate significant differences in different structures of fruit (P<0.05)Fig. 7　Analysis of Lb WRKY3 gene expression pattern in different structures of fruit

2.5.2LbWRKY3在果实发育不同阶段的表达分析利用实时定量PCR法分析LbWRKY3在枸杞果实发育不同阶段表达量的变化规律(图 6)。结果表明在果实的5个发育阶段，其表达量逐渐升高，在果实发育第1阶段表达量最低，35 d时LbWRKY3达到峰值，并且果实发育不同阶段表达量的差异均达到极显著水平。

2.5.3LbWRKY3在成熟果实不同组织的表达分析通过分析LbWRKY3在成熟果实不同组织中的表达量，发现LbWRKY3在果肉中的表达量较高，果皮中的表达量次之，而在种子中的表达量则较低(图 7)，并且成熟果实不同组织表达量的差异均达到极显著水平。

3　讨　论

本研究利用植物WRKY蛋白的保守序列通过同源克隆与RACE方法成功获得了一个枸杞WRKY转录因子全长cDNA序列，命名为LbWRKY3。LbWRKY3基因编码蛋白有1个典型的WRKY结构域， 结构域C端具有1个C2H2的锌指结构，与案头菊WRKY7(ChrysanthemumxmorifoliumKC615361.1)、黄花蒿WRKY1(ArtemisiaannuaFJ390842.1)蛋白相似度较高，较为保守，属于第二类WRKY转录因子。

WRKY转录因子参与调控植物形态发生，在植物体内并非组成型表达，而是受各种环境因子的诱导表达，其表达具有快速瞬时等特点，同时具有组织特异性。已有研究发现：拟南芥AtWRKY1基因主要调控植株根和花的形态建成，仅在根和花组织细胞中表达，在茎、叶和长角果组织中未见表达[9]。野生马铃薯ScWRKY1转录因子在叶中的表达水平很高，在茎和根中的表达水平很低，在胚胎形成过程中起着重要的调节作用，发育的种子中几乎不表达，在受精后16 d左右的鱼雷期胚胎中有瞬时高表达[10]。本研究发现LbWRKY3在枸杞根、茎、叶、花和果实中均有表达，且在根中的表达水平相对最高，在花中的表达量最低。

此外， WRKY基因参与调节植物发育过程。如燕麦ABF1和ABF2参与种子萌发及萌发后生长[11]；ScWRKY1参与豆科植物种子休眠、茄属植物胚形成[12]。拟南芥TTG2控制表皮毛的早期发育、黏液的产生和鞣质合成，在表皮毛、种子内表皮以及根的无毛体整个发育时期表达[13-14]；AtWRKY75基因受抑制后，导致侧根的数目和长度、根毛的数目变化[15]。拟南芥AtWRKY6转录因子在幼叶和成熟叶片几乎不表达，叶片衰老的发生过程中，AtWRKY6基因的表达不断增强，调控叶片衰老的信号转导途径建立[16-17]。本研究发现LbWRKY3调控枸杞果实发育。该基因在枸杞果实发育的所有时期均检测出表达，果实发育初期(第1阶段)表达量较低，伴随着果实生长LbWRKY3相对表达量迅速升高，果实成熟期(第5阶段)达到峰值，整个过程LbWRKY3的表达呈现由低升高，成熟时到达最大值的趋势。在发育成熟枸杞果实不同组织中LbWRKY3表达量差异显著，果肉中的表达量较高，果皮中的表达量次之，而在种子中表达量则较低。

WRKY基因是植物生长发育、环境适应过程中的重要调节因子，改良或增强一个关键转录因子的调控能力来提高作物的品质将是一种更为有效的改良作物品质的方法和途径[18]。分离调控多种代谢基因表达的WRKY转录因子基因，为开展植物分子育种开辟了新的途径。

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(编辑:宋亚珍)

Cloning and Tissue Expression Analysis ofWRKY3Gene inLyciumbarbarumL.

XU Huijuan, ZHENG Rui，CHEN Ren, WANG Yancai, WANG Lijuan*

(College of Life Science, Ningxia University, WBRPU Lab of National Education Ministry, Yinchuan 750021, China)

With wolfberry (LyciumbarbarumL.) as material, polymerase chain reaction (PCR) combined with RACE technology were used to clone a cDNA ofWRKYfrom wolfberry, named asLbWRKY3. (GenBank accession No.KX196192). Meanwhile, on the basis of bioinformatic analysis, we performed the subcellular localization assays and tissue-specific expression analysis. The results indicated that: (1)LbWRKY3has an open reading frame(ORF) of 1 068 bp, which encoded a protein of 356 amino acid residues. (2)Bioinformatic analysis indicated that Lb WRKY3protein contains the one conserved WRKY motifs, the predictive secondary structure showed that Lb WRKY3protein was made up of 15.82% alpha-helix, 6.63% beta-turn, 18.88% extended strand and 58.67% random coil. Lb WRKY3protein showed the highest homology identity with WRKY protein fromChrysanthemumxmorifoliumandArtemisiaannua. (3)Subcellular localization assays showed that the Lb WRKY3protein was located in the nucleus. (4)Real-time PCR analysis indicated thatLbWRKY3was expressed in high transcript level in roots, low levels in flower. TheLbWRKY3gene expression could be detected during the whole period of fruit development. Interestingly,LbWRKY3gene showed a high transcription level in 35 days. The expression level in the pulp was higher than that in the seed and peel .LbWRKY3gene takes part in fruit development and sugar accumulation in wolfberry.

wolfberry; WRKY transcription factors; fruit development; expression pattern

1000-4025(2016)09-1721-07doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1721

2016-05-30;修改稿收到日期:2016-08-23

国家自然科学基金(31260065, 31360363); 2013年中国科学院西部之光项目

徐惠娟(1979-)，女，硕士，讲师，主要从事植物分子生理生态研究。E-mail：xu_hj@nxu.edu.cn

王丽娟，博士，副教授，主要从事植物基因工程研究。E-mail：mnn717@163.com

Q785；Q789

A