果皮酵素的制备及抗氧化活性研究

张淑华，叶柳健，张振鑫，窦伟浩，李洋

（长春理工大学生命科学技术学院，长春　130022）

果皮酵素的制备及抗氧化活性研究

张淑华，叶柳健，张振鑫，窦伟浩，李洋

（长春理工大学生命科学技术学院，长春130022）

本文研究以新鲜果皮为原料，采用市面常用菌种来发酵制备果皮酵素。为进一步优化果皮酵素的发酵工艺参数，以超氧化物歧化酶（SOD）活力为测定指标，通过正交试验确定果皮酵素的最优发酵条件。结果表明，糖浓度为25%，发酵时间为36h，接种量为6%，发酵温度为30℃时发酵效果最好。该条件下果皮酵素的超氧化物歧化酶（SOD）活力平均值为46.84U/ml。该研究为果皮酵素的制备和抗氧化活性研究奠定了基础。

果皮酵素；抗氧化活性；超氧化物歧化酶

酵素是一种由氨基酸组成的具有特殊生物活性的物质，在维持机体正常功能，分解代谢、修复组织、抗氧化等方面具有不可替代的功效。

生物体内的各种生理生化反应，几乎都要在酵素的催化作用下进行，人体的新陈代谢、能量摄取、成长和繁殖等生命现象，都必须通过酵素的帮助才能完成。身体中酵素的多少与其活性高低和人体的衰老及疾病息息相关［1］。在我们一生中有大量的酵素被随意地浪费掉了，烹饪食物、精加工食物以及食用酒精、药物及垃圾食品等行为都会消耗我们体内的酵素，无酵素的食物就会过多的消耗我们体内的酵素，经常感冒，发烧也会消耗我们的酵素补给。目前，现代社会竞争激烈，生活节奏加快，环境污染以及年龄增长，都会导致人体内的酵素大大减少。研究表明人类的动脉硬化、炎症、糖尿病、癌症等多种疾病和衰老等都与活性氧和自由基有关［2-4］。由于机体中过量的自由基会引起蛋白质变性、DNA损伤、细胞死亡乃至机体的病变［5］，因此，国内外的很多研究都在寻找富含天然抗氧化性成分的食品来防治自由基引起的疾病。

酵素源于日本，主要以稻米为原料发酵生产。截至目前，其研发和生产工艺均是世界先进水平，且尚属保密阶段［6］。目前，国内市场上也出现了一些添加酵素的保健食品，但在其它食品领域中，酵素的应用还很少，仍然有广阔的发展空间。鉴于此，酵素产品无论是发酵过程还是酵素生产工艺都有进一步发展的必要性［7］。本文是利用微生物的发酵作用获得酵素，通过对酵素发酵条件的探讨与优化，找出最优的酵素发酵条件，替代传统自然发酵所制备的酵素，具有实际应用价值。研究果皮酵素具有的超氧化物歧化酶的活力，为进一步探明果皮酵素中的抗氧化活性提供一定的数据资料，为新型抗氧剂的开发提供了新的思路。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

橘子皮；火龙果皮；香蕉皮；市售红糖；市售安琪高活性干酵母和双歧杆菌发酵剂；邻苯三酚（分析纯）。

1.2仪器与设备

恒温培养箱；UV2250型紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；电子天平；超净工作台；灭菌锅。

1.3实验方法

1.3.1酵素指标的检测

超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定：采用邻苯三酚自氧化法［8-10］。超氧化物歧化酶活力定义：在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位（U），即在325nm波长处测定时，每分钟光吸收值为一个活性单位［11］。1.3.2菌种的选择

（1）用安琪酵母菌进行发酵

用蒸馏水清洗果皮，将果皮表面的沙子和灰尘洗掉，然后将果皮切碎，称取50g果皮装到玻璃瓶中，加入糖浓度为15%的红糖水98ml后，放入灭菌锅，115℃下灭菌30min。将灭菌后冷却至室温的玻璃瓶在超净工作台中按接种量为2%接种安琪高活性干酵母，放入30℃恒温箱中进行发酵，24h后获得酵素并通过邻苯三酚自氧化法测定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性来间接确定酵素的抗氧化活性。

（2）用双歧杆菌发酵剂进行发酵

用蒸馏水清洗果皮，将果皮表面的沙子和灰尘洗掉，然后将果皮切碎，称取50g果皮装到玻璃瓶中，加入糖浓度为15%的红糖水98ml后，放入灭菌锅，115℃下灭菌30min。将灭菌后冷却至室温的玻璃瓶在超净工作台中按接种量为2%接种双歧杆菌，放入30℃恒温箱中进行发酵，24h后获得酵素并通过邻苯三酚自氧化法测定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性来间接确定酵素的抗氧化活性。

比较这两种市面上常见的菌种发酵得到酵素的抗氧化活性，得出发酵效果好的菌种。

1.3.3不同果皮来进行发酵

（1）用火龙果皮发酵

用蒸馏水清洗火龙果皮，将果皮表面的沙子和灰尘洗掉，然后将果皮切碎，称取50g果皮装到玻璃瓶中，加入糖浓度为15%的红糖水98ml后，放入灭菌锅，115℃下灭菌30min。将灭菌后冷却至室温的玻璃瓶在超净工作台中按接种量为2%接种上个实验所得出的发酵效果好的菌种，放入30℃恒温箱中进行发酵，24h后获得酵素并通过邻苯三酚自氧化法测定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性来间接确定酵素的抗氧化活性。

（2）用香蕉皮进行发酵

用蒸馏水清洗香蕉皮，将果皮表面的沙子和灰尘洗掉，然后将果皮切碎，称取50g果皮装到玻璃瓶中，加入糖浓度为15%的红糖水98ml后，放入灭菌锅，115℃下灭菌30min。将灭菌后冷却至室温的玻璃瓶在超净工作台中按接种量为2%接种上个实验所得出的发酵效果好的菌种，放入30℃恒温箱中进行发酵，24h后获得酵素并通过邻苯三酚自氧化法测定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性来间接确定酵素的抗氧化活性。

（3）用橘子皮进行发酵

用蒸馏水清洗橘子皮，将果皮表面的沙子和灰尘洗掉，然后将果皮切碎，称取50g果皮装到玻璃瓶中，加入糖浓度为15%的红糖水98ml后，放入灭菌锅，115℃下灭菌30min。将灭菌后冷却至室温的玻璃瓶在超净工作台中按接种量为2%接种上个实验所得出的发酵效果好的菌种，放入30℃恒温箱中进行发酵，24h后获得酵素并通过邻苯三酚自氧化法测定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性来间接确定酵素的抗氧化活性。

比较不同果皮发酵生产酵素的效果。

1.3.4改变不同的发酵条件进行发酵

（1）糖浓度对果皮酵素发酵的影响

用蒸馏水清洗果皮，将果皮表面的沙子和灰尘洗掉，然后将果皮切碎，分别称取50g果皮装到5个玻璃瓶中，糖浓度分别为设置为10%、15%、20%、25%、30%，放入灭菌锅，115℃下灭菌30min。在超净工作台中将灭菌后冷却至室温的玻璃瓶中按接种量为2%接入菌种，放入30℃恒温箱中进行发酵，24h后获得酵素并通过邻苯三酚自氧化法测定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性来间接确定酵素的抗氧化活性。

（2）接种量对果皮酵素发酵的影响

用蒸馏水清洗果皮，将果皮表面的沙子和灰尘洗掉，然后将果皮切碎，分别称取50g果皮装到5个玻璃瓶中，糖浓度设置为20%，放入灭菌锅，115℃下灭菌30min。在超净工作台中将灭菌后冷却至室温的玻璃瓶中按接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%接入菌种，放入30℃恒温箱中进行发酵，24h后获得酵素并通过邻苯三酚自氧化法测定所得酵素的超氧化物歧化酶（SOD）的活性来间接确定酵素的抗氧化活性。

1.3.5发酵条件优化正交试验

根据以往的单因素试验研究结果，以超氧化物歧化酶（SOD）活力为考察指标，选取糖浓度、接种量、发酵时间和发酵温度等因素，采用L9（34）正交方法进行试验设计［12］，优化酵母接种量、发酵时间及温度等工艺参数，正交试验因素与水平见表1。该优化研究中每次试验果皮原料用量为50g，用于确定发酵的工艺参数。

表1　正交试验因素水平表

1.3.6验证试验

用蒸馏水清洗果皮，将果皮表面的沙子和灰尘洗掉，然后将果皮切碎，称取50g果皮装到玻璃瓶中，按照正交实验所确定的最优发酵工艺进行重复性试验［13］。

2　结果与分析

2.1菌种的选择

表2　不同菌种发酵抗氧化活性结果

通过用安琪高活性干酵母和双歧杆菌发酵剂分别对果皮进行发酵，得到两瓶果皮酵素。测定这两瓶酵素的抗氧化活性，结果如表2所示。结果表明用安琪高活性干酵母来发酵所得到的酵素抗氧化活性要比用双歧杆菌发酵剂发酵所得酵素要高。因此，用安琪高活性干酵母作为菌种发酵生产酵素效果好。

2.2不同果皮来进行发酵

通过用安琪高活性干酵母分别对火龙果皮、香蕉皮以及橘子皮进行发酵，得到三瓶果皮酵素。测定这三瓶酵素的抗氧化活性，结果如表3所示。结果表明橘子皮酵素的抗氧化活性＞香蕉皮酵素＞火龙果皮酵素。

表3　不同果皮发酵抗氧化活性结果

2.3糖浓度对果皮酵素发酵的影响

通过改变不同的糖浓度对果皮进行发酵得到果皮酵素。测定所得酵素的抗氧化活性，其结果如图1所示。结果显示在一定范围内果皮酵素的抗氧化活性随糖浓度的增大而变大；当达到一定程度后，随糖浓度的增加果皮酵素的抗氧化活性反而减小。

图1　不同糖浓度发酵抗氧化活性结果

2.4接种量对果皮酵素发酵的影响

通过改变菌种的接种量对果皮进行发酵得到果皮酵素。测定所得酵素的抗氧化活性，其结果如图2所示。结果显示不同的接种量对发酵有很大的影响，得到的果皮酵素抗氧化活性各不相同，其中接种量为2%时抗氧化活性最大。

图2　不同接种量发酵抗氧化活性结果

2.5发酵条件优化正交试验

由表可知，通过对各因素的K、k及R的大小进行计算，可以得出，A因素以A3水平最佳；B因素以B3水平最佳；C因素以C3水平最佳；D因素以D2水平最佳。从R值可以判断出各因素对超氧化物歧化酶活力指标影响的主次顺序为A（糖浓度）＞C（发酵时间）＞B（接种量）＞D（发酵温度）。故果皮酵素发酵的最佳工艺条件为A3C3B3D2，即糖浓度为25%，发酵时间36h，接种量为6%，发酵温度30℃。

表4　正交试验实施表

2.6验证试验

以正交试验所得出的最优发酵工艺进行发酵得到酵素，进行重复性试验，测其抗氧化活性。结果如表5所示。从表5可以看出，各重复的超氧化物歧化酶活力稳定，平均值为46.84U/ml，重复性好，变异系数1.868%，说明该发酵工艺稳定可行。

表5　验证试验结果

3　结论

以新鲜果皮为原料、安琪高活性干酵母作为菌种来发酵制备果皮酵素。通过用不同果皮来进行发酵制备酵素，结果表明橘子皮酵素的抗氧化活性＞香蕉皮酵素＞火龙果皮酵素。改变不同的发酵条件进行发酵，得出在一定范围内果皮酵素的抗氧化活性随糖浓度的增大而变大，在达到一定程度后，随糖浓度的增加果皮酵素的抗氧化活性反而减小；不同的接种量发酵所得到的果皮酵素抗氧化活性各不相同，其中接种量为2%时活性最大。为进一步优化果皮酵素的发酵工艺参数，以超氧化物歧化酶（SOD）活力为测定指标，通过正交试验确定果皮酵素的最优发酵条件。结果表明，每50g果皮原料，糖浓度为25%，发酵时间为36h，接种量为6%，发酵温度为30℃时发酵效果最好。该条件下果皮酵素的超氧化物歧化酶（SOD）活力平均值为46.84U/ml。验证试验结果表明该工艺条件稳定可行，重复性好，为果皮酵素的制备奠定了基础。超氧化物歧化酶活力测定结果表明果皮酵素的抗氧化活性很高，为其在抗氧化活性制剂开发方面提供了借鉴。

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Preparation and Antioxidant Activity of Peel Enzyme

ZHANG Shuhua，YE Liujian，ZHANG Zhenxin，DOU Weihao，LI Yang
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

We used some common strains to prepare peel enzyme with fresh fruit as raw material.In order to optimize the peel enzyme fermentation process parameters，superoxide dismutase（SOD）activity was determined in orthogonal test.The results showed that the optimum conditions for fermentation were as follow：Sugar concentration of is 25%，fermentation time is 36h，Inoculation is 6%，fermentation temperature is30℃，SOD activity is 46.84 U/ml in average.It lays the foundation for further research on preparation and antioxidant activity of peel enzyme

peel enzyme；antioxidant activity；superoxide dismutase

TS255.1

A

1672-9870（2016）04-0063-04

2016-03-15

博士后经费（40301/870）

张淑华（1972-），女，副教授，硕士生导师，E-mail：zhangsh1018@126.com