30例大前庭水管综合征患者SLC26A4基因诊断与听性脑干电位特性分析

高东梅,刘洪泉,金　鹏,于姝媛,王　苹,杜　波

(吉林大学第一医院 耳鼻咽喉头颈外科,吉林 长春130021)



30例大前庭水管综合征患者SLC26A4基因诊断与听性脑干电位特性分析

高东梅,刘洪泉,金鹏,于姝媛,王苹,杜波*

(吉林大学第一医院 耳鼻咽喉头颈外科,吉林 长春130021)

大前庭水管综合征(Largevestibularaqueductsyndrome,LVAS)是一种临床常见的先天性内耳畸形疾病，属于常染色体隐性遗传性非综合征型听力障碍性疾病，发病率占儿童和青少年感音神经性聋的1%-12%[1]。主要表现为波动性和进行性感音神经性听力下降，发病年龄可以从出生后至青春期的任何年龄段。目前临床诊断主要是颞骨高分辨率薄层CT扫描、SLC26A4基因突变筛查和听性脑干电位检测。本文收集了我科门诊经颞骨CT扫描证实为LVAS的患者，通过听力学检测及耳聋基因芯片检测，比较分析SLC26A4基因突变和脑干电位(ABR)检测在LVAS临床诊断过程中的特异性。

1　材料和方法

1.1临床资料

检测对象为2012年3月-2014年3月在吉林大学第一医院耳鼻咽喉科就诊，经颞骨CT扫描证实为LVAS的患者30例，年龄5.5-28岁，不伴有其他临床症状和体征。所有受检者在进行基因检测前均已签署知情同意书。

1.2纯音测听和听觉脑干电位检测

纯音听阈测试:检查在隔声室内进行,应用AC40型纯音听力计测试纯音听阈。ABR检测使用GSI-Audera听觉诱发电位仪，短声刺激，频率为20次/秒，叠加1000次。ER-3A型插入式耳机。纽扣式电极,记录置于发际,鼻根为地极,参考分别置于双侧乳突。记录ABRI、III和V波潜伏期和V波反应阈。听力损失分级根据1997年WHO制订的标准判定。

1.3耳聋易感基因芯片检测

取患儿外周静脉血，EDTA-Na2抗凝处理，采用TIANampBloodDNAKit按说明书操作分离全基因组DNA。基因芯片检测采用遗传性耳聋基因检测芯片试剂盒(北京博奥生物工程公司)，按说明书操作。首先针对9个突变位点的9组引物分成两个反应体系分别进行多重PCR扩增，扩增后PCR产物加热至95℃变性5min，加入到10μl杂交缓冲液，将混合液加到芯片的点样区域，加盖玻片,封闭杂交盒,50℃预热杂交箱中保温1h。杂交结束后取出芯片，摇床洗涤2min，置入离心机中以1 200r/min离心2min甩干。使用晶芯LuxScanTM10K/B微阵列芯片扫描仪以90的激光扫描强度和532nm激发波长进行芯片扫描，相应软件系统判读杂交信号并进行结果分析,对信号不清的样本，异地双盲法验证。

1.4统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学分析，采用χ2检验，McNemar检测，P<0.05认为有统计学意义。

2　结果

2.1耳聋基因芯片检测结果

采用晶芯耳聋九项，检测LAVS患者SLA26A4 基因最常见的2个突变位点，IVS7-2A>G和 2168A>G。 30例受检患儿中，耳聋基因突变阳性的有28例，占93.3%，其中SLC26A4基因纯合和复合突变为15例，单杂合13例。见图1，具体患者基因表型见表1。

图1　SLA26A4基因IVS 7-2 A>G 和 2168 A>G突变杂交图表1　30例PDS患者ASNR和基因突变分析

编号发病年龄听力损失(L/R)ASNR(L/R)PDS基因型CT扫描(L/R)12345678910111213141516171819202122232425262728293023出生出生342312371224511出生出生67433541122重度/重度重度/重度重度/重度重度/重度中度/中度中度/重度中度/重度重度/中度中度/重度中度/重度中度/中度重度/重度重度/中度重度/中度重度/中度中度/重度中度/中度重度/重度重度/重度重度/重度重度/中度重度/中度重度/中度重度/重度重度/重度重度/重度重度/中度重度/重度重度/重度轻度/轻度+/++/+-/--/+-/-+/++/++/-+/++/++/+-/--/--/+-/+-/-+/++/++/++/+-/+-/--/+-/--/--/-+/++/++/+-/-IVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wt2168A>G/IVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wt2168A>G/IVS7-2A>G2168A>G/IVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>GwtIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GIVS7-2A>GwtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wtIVS7-2A>G/wt2168A>G/wt+/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/++/+

2.2听觉脑干电位检测声诱发短潜伏期负反应(ASNR)结果

听性脑干反应(ABR)在90dB声强诱导出电位反应波，根据潜伏期和振幅变化判断负波相位置，确认ASNR，见图2箭头所示。结果发现，30例中20例患者，有34耳出现ASNR，见图1，26耳阴性，ASNR阳性率为66.6%。

2.3SLC26A4基因突变与ASNR的相关性

对30例患者经颞骨CT扫描证实为LVAS的患者行ABR和基因芯片检测，耳聋基因芯片检测的检出率要高于ABR的ASNR特性。结果对比分析见表1， 30例患者，13例PDS基因呈杂合状态，15例纯合或复合杂合。2例PDS基因呈野生型。对2例PDS基因呈野生型患者进行SLC26A4全基因测序分析结果显示,1例1279T>C和2027T>A复合杂合,1例未见SLC26A4基因异常。20例ABR检测引出ASNR，检出率为66.6%。比较听力损失程度和SLC26A4基因突变常见位点与ASNR引出的相关性，结果未见统计学差异。

A：正常人ABR检测图，B：LVAS患者的ABR检测图图2　ABR检测结果为ASNR

3　讨论

大前庭水管综合征在出生时多数患者听力正常，在很长的一段时间内以渐进性出现听力下降，诱因常与轻微颅外伤或气压性创伤有关，听力学改变以感音神经性耳聋和混合性聋为主。诊断前庭水管扩大的金标准是影像学，颞骨高分辨CT显示前庭水管外口宽度超过1.5mm即可诊断为大前庭水管综合征。结合遗传咨询、听力损失临床特征和影像学结果，Everett等[2]提出大前庭水管综合征是常染色体隐性遗传病，SLC26A4基因突变是导致大前庭水管综合征的遗传学基础。国内外学者[3-5]的研究发现，SLC26A4基因具有突变热点，且具有种族特异性，在亚洲人群IVS7-2A>G和2168A>G是常见突变热点。我们通过分析30例患者基因芯片耳聋九项筛查的结果发现，SLC26A4基因突变阳性检出28例，其中纯合和复合突变为15例，单杂合13例，根据隐性遗传规律，致病基因纯合和复合杂合突变可以确诊，而单杂合突变不能进行诊断，推测可能存在IVS7-2A>G和2168A>G突变位点以外的突变位点，表明SLC26A4基因是引起大前庭水管综合征的常见基因。SLC26A4基因编码的蛋白Pendrin是780个氨基酸构成的跨膜蛋白，开放阅读框架2 343bp，由21个外显子组成。朱发梅等采用基因芯片联合PCR产物直接测序的方法，在30例大前庭水管综合征患者中，共检出28例有SLC26A4基因突变(93.33%)。发现16种突变类型，其中ⅣS7-2A>G突变的发生率最高，其次为2168A>G。16种突变中有5种剪接点突变，9种错义突变和2种无义突变，这些突变分布于SLC26A4基因的大多数外显子和部分内含子上[6]。另外大前庭水管综合征可能存在其他的基因异常。Yang等[7]报道l例LVAS患者为SLC26A4和FOXI1复合杂合突变，说明了LVAS双基因调控遗传方式，FOXIl基因可能参与SLC26A4的转录调控，导致LVAS疾病的发生。SLC26A4基因IVS7-2A>G和2168A>G是常见突变热点，利用基因芯片可对LVAS进行快速筛查，发现致病原因，但无法发现其它的突变位点，因此对基因芯片检测发现SLC26A4基因突变单杂合的患者还需要进行DNA测序和影像学检查。

近年来国内外研究者发现在听性脑干反应检测中LVAS具有特征性表现。即在高刺激强度(≥90dBnHL)时出现负相波，潜伏期为3.26±0.57ms。Nong等[8]将此反应称为声诱发短潜伏期负反应。国内郝剑萍等通过对大前庭水管综合征与内耳其他畸形的听性脑干反应特性进行分析，结果发现，LVAS组的ASNR检出率为54%，而其他内耳畸形未出现ASNR。王秋菊等观察到75.7% 的LVAS出现ASNR[9-10]。我们对30例LVAS患者进行常规ABR检测发现ASNR阳性率为66.6%。进一步证实ASNR是LVAS临床听力学特征性表现,而且GJB2基因突变引起的DFNB1遗传性耳聋未引出ASNR，认为通过观察ASNR是否引出可对LVAS进行早期诊断。

我们将30例同时进行基因芯片、ABR检测和颞骨CT扫描的诊断资料汇总分析发现，50%(15例)患者SLC26A4基因突变呈纯合或复合杂合，43%(13例)SLC26A4基因突变单杂合，推测可能存在IVS7-2A>G和2168A>G以外的其他突变位点。2例野生型，经测序分析1例为1279T>C和2027T>A复合杂合，1例为野生型，可能存在其他的致病机制。其中1例CT扫描未出现前庭水管外口扩大，但基因芯片显示IVS7-2A>G突变纯合，未纳入结果分析，推测CT扫描阴性与扫描位置有关。30例LVAS病例10例未检出ASNR，检出率为66.6%。尽管LAVS病例并不是全部表现出ASNR，但出现ASNR的耳聋患者可高度怀疑为LVAS，迄今尚未在其他内耳畸形的病例引出ASNR。

综上所述，对出现LVAS临床特征的病人，常规ABR检测可以监测听力损失程度变化，判断耳聋类型，通过是否引出ASNR，可初步判断LVAS。进一步明确病因还需要进行SLC26A4基因突变检测，而基因芯片因只包括常见的IVS7-2A>G和2168A>G突变热点，可作为基因诊断的初筛手段，对于LVAS患儿，基因芯片诊断为杂合或野生型，父母希望生育第二个孩子，则必须进行SLC26A4全基因测序，发现致病的突变位点，并对胎儿进行产前诊断，才能有效避免耳聋出生。

[1]GriffithAJ,ArtsA,DownsC,etal.Familiallargevestibularaqueductsyndrome[J].Laryngoscope,1996,106(8):960.

[2]EverettLA,GlaserB,BeckJC,etal.Pendredsyndromeiscausedbymutationsinaputativesulphatetransportergene(PDS)[J].NatGenet,1997,17:411.

[3]СhurbanovAY,KarafetTM,MorozovIV,etal.WholeExomeSequencingRevealsHomozygousMutationsinRAI1,OTOF,andSLC26A4GenesAssociatedwithNonsyndromicHearingLossinAltaianFamilies(SouthSiberia)[J].PLOSOne,2016,11(4):e0153.

[4]AlbertS,BlonsH,JonardL,etal.SLC26A4geneisfrequentlyinvolvedinnonsyndromichearingimpairmentwithenlargedvestibularaqueductinCaucasianpopulations[J].EurJHumGenet,2006,14(6):773.

[5]HuangS,HanD,WangG,etal.SensorineuralhearinglosscausedbymutationsintwoallelesofbothGJB2andSLC26A4genes[J].IntJPediatrOtorhinolaryngol,2013,77(3):379.

[6]朱发梅，胡鹏，赖若沙，等.基因芯片联合DNA测序法在大前庭水管综合征因诊断中的应用[J].中华耳科学杂志，2011，9(2)：168.

[7]YangT，VidarssonH，Rodrigo-BlomqvistS，etal.TranscriptionalcontrolofSLC26A4isinvolvedinPendredsyndromeandnonsyndromicenlargementofvestibularaqueduct(DFNB4)[J].AmeJHumGenet，2007，80(6):1055.

[8]NongDX,UraM,OwaT,etal.Anacousticallyevokedshortlatencynegativeresponseinprofoundhearinglosspatients[J].ActaOtolaryngol,2000,120(8):960.

[9]郝剑萍，赵岩，闫文斐，等.大前庭水管综合征与内耳其他畸形的听性脑干反应特性分析[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010,24(13)：598.

[10]王秋菊,韩东一,兰兰,等.大前庭水管综合征的诊治策略研究[J].中华耳科学杂志,2006,4(4):315.

吉林省卫计委科技项目(2014Z048)

1007-4287(2016)09-1586-04

2015-01-19)