Wortmannin对糖尿病大鼠肺组织Caspase-3与Caspase-9表达的影响

梁英杰,周德鹏,曹东华

(1.辽河油田总医院 检验科,辽宁 盘锦124010;2.中国人民解放军第二○二医院 检验科,辽宁 沈阳110003)



Wortmannin对糖尿病大鼠肺组织Caspase-3与Caspase-9表达的影响

梁英杰1,周德鹏1,曹东华2

(1.辽河油田总医院 检验科,辽宁 盘锦124010;2.中国人民解放军第二○二医院 检验科,辽宁 沈阳110003)

目的研究Wortmannin对糖尿病大鼠肺组织Caspase-3与Caspase-9表达的影响。方法60只大鼠随机分为对照组(20)、糖尿病组(20) 和Wortmannin处理组(20)，通过高糖、高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)的方法建立2型糖尿病大鼠模型。糖尿病模型建立后，检测血糖、血脂及体重的改变；采用免疫组织化学方法和Western blot方法检测各组大鼠肺组织中Caspase-3与Caspase-9表达的变化情况。结果与对照组比较，糖尿病模型组大鼠血糖、血脂值明显增高，P<0.01；与糖尿病模型组比较，Wortmannin处理组大鼠血糖、血脂值明显降低，P<0.01。免疫组织化学和Western blot 结果显示，糖尿病模型组大鼠肺组织Caspase-3与Caspase-9的表达量均显著高于对照组，P<0.01；而与糖尿病模型组比较，Wortmannin处理组大鼠肺组织Caspase-3与Caspase-9的表达量均显著降低。结论PI3K/Akt信号通路可能通过调节Caspase-3与Caspase-9的表达参与糖尿病肺组织病变的发生发展。

糖尿病；肺；磷脂酰肌醇3激酶；Caspase-3；Caspase-9；大鼠

(ChinJLabDiagn,2016,20:1428)

随着社会的进步,人们生活水平的提高以及生活方式的改变，2型糖尿病的发病率快速增高,正严重地危害着人类的健康。2型糖尿病是一种严重的慢性疾病，其病因及机制非常复杂。糖尿病对人类的危害不仅是机体内环境中血糖浓度的升高，更重要的是对机体各个脏器的损害，引发诸多并发症，包括感染、视网膜病变、心脑血管硬化、神经传导延缓以及肾脏功能改变[1-3]。糖尿病肺病(Diabetes lung disease，DLD) 是糖尿病的并发症之一，是导致糖尿病晚期死亡的一个重要原因[4]。因此，延缓糖尿病肺病的病理进程，对改善预后、降低死亡率有重要的临床意义。本研究通过建立糖尿病大鼠模型，检测PI3K/Akt信号通路被阻断后，DM大鼠肺组织中Caspase-3与Caspase-9表达的变化情况，探讨糖尿病肺损伤的可能发生机制。

1　材料与方法

1.1试剂和仪器

羊抗大鼠Caspase-3和 Caspase-9多克隆抗体(Santa-Cruz)，链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，血糖试剂盒(上海复旦张江生物医药股份有限公司)，Sure Step Plus血糖检测仪(美国强生公司)。全自动血液生化分析仪(意大利爱康公司)，凝胶成相系统(Gel DocTM，美国Bio-Rad 公司)。

1.2动物分组及模型的建立

60只健康雄性SD 大鼠，购自中国医科大学实验动物中心，250-300 g，随机分为对照组(20)使用普通饲料喂养，糖尿病组(20)和Wortmannin处理组(20)高脂饲料喂养76 d后，空腹12 h后，糖尿病组腹腔注射STZ(30 mg/kg)，对照组注射枸橼酸缓冲液。72 h后尾静脉取血测定血糖，将血糖浓度≥10.0 mmol/L大鼠定为糖尿病造模成功，糖尿病模型建立后,每周监测血糖1次,不符合标准者弃去。糖尿病模型建立次日起，Wortmannin处理组静脉注射Wortmannin(0.5 mg/kg),1次/周,共12 W，第12周禁食12-14 h测定血糖后,麻醉处死大鼠，取材。

1.3血糖血脂测定

糖尿病模型建立后第12周，禁食12-14 h，采集血样，利用SureStep Plus 血糖检测仪测定血糖，全自动血液生化分析仪测定血脂。

1.4免疫组织化学方法测定Caspase-3和Caspase-9表达

糖尿病模型建立后第12周，禁食12-14 h，麻醉处死大鼠，开胸，剪开右心耳，生理盐水冲洗，然后多聚甲醛灌流固定，取肺组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，再移入30%蔗糖溶液中脱水至沉底，石蜡包埋，常规切片，按照SP试剂盒说明测定Caspase-3和 Caspase-9表达。

1.5Western blot方法检测Caspase-3和Caspase-9表达

糖尿病模型建立后第12周，禁食12-14 h，麻醉处死大鼠，冰上开胸，取肺组织，超声粉碎，离心取上清，以BCA法测定样品蛋白含量，计算上样量，样品经沸水浴变性后，上样，电泳分离，转印，杂交，暗室内ECL发光，X光片显影、定影，凝胶图像分析仪采集分析图像光密度值。

1.6统计分析

2　结果

2.1大鼠的一般情况及血糖、血脂测定结果

糖尿病组大鼠在注射STZ后，呈明显多饮、多食、多尿症状，明显消瘦，并伴不同程度精神萎靡，毛竖而无光泽；而对照组大鼠精神状况良好，体重明显增加，毛皮有光泽。正常对照组大鼠空腹血糖浓度为(5.06±0.92) mmol/L，显著低于糖尿病组大鼠(18.17±4.98) mmol/L，P<0.01，与糖尿病组大鼠相比，Wortmannin处理组大鼠空腹血糖浓度(10.21±2.57) mmol/L显著降低，P<0.01。正常对照组大鼠血脂浓度为(1.52±0.27) mmol/L，显著低于糖尿病组大鼠(2.37±0.36) mmol/L，P<0.01；与糖尿病组大鼠相比，Wortmannin处理组大鼠空腹血脂浓度(1.91±0.27) mmol/L显著降低，P<0.01。

2.2免疫组织化学方法测定Caspase-3和Caspase-9表达结果

对免疫组化结果进行图像分析，结果发现，对照组大鼠肺组织凋亡因子Caspase-3和Caspase-9仅有微量表达，显著低于糖尿病组与Wortmannin处理组，P<0.01；而与糖尿病组相比，Wortmannin处理组大鼠肺组织凋亡因子Caspase-3和Caspase-9的表达显著降低，P<0.01，见图1，表1。

2.3Western blot方法测定Caspase-3和 Caspase-9表达结果

对免疫组化结果进行图像分析，结果发现，与对照组比较，糖尿病组与Wortmannin处理组大鼠肺组织凋亡因子Caspase-3与Caspase-9蛋白的表达量均显著升高，P<0.01；而与糖尿病组相比，Wortmannin处理组大鼠肺组织凋亡因子Caspase-3和 Caspase-9的表达显著降低，P<0.01，见图2，表2。

A:对照组; B:糖尿病组; C:Wortmannin处理组图1　免疫组化法检测Caspase-3 和Caspase-9表达表1　Caspase-3 和 Caspase-9平均光密度值 (MOD)比较

nCaspase-3Caspase-9对照组100.18±0.030.19±0.03糖尿病组100.52±0.15*0.43±0.11*Wortmannin处理组100.31±0.090.27±0.09

*与对照组或Wortmannin处理组比较,P<0.01

A:对照组;B:糖尿病组;C:Wortmannin处理组图2　Western blot方法测定Caspase-3和 Caspase-9表达表2　Caspase-3 和 Caspase-9平均光密度 值(MOD)比较

nCaspase-3Caspase-9对照组100.33±0.060.24±0.04糖尿病组100.85±0.16*0.51±0.13*Wortmannin处理组100.55±0.120.36±0.11

*与对照组或 Wortmannin 处理组比较,P<0.01

3　讨论

糖尿病(DM)是一种危害人类健康的慢性疾病，其发病机制复杂，并且对心、脑、肾有显著的影响。研究发现，肺脏也是DM 损伤靶器官之一，DM本身可导致肺脏损害，可发展为慢性肺功能障碍，可以出现限制性通气功能障碍和弥散、阻塞性及混合性通气功能障碍，损伤机制可能与高糖诱导氧化应激损伤、炎症反应、PKC 信号传导通路增强等有关[5,6]，但是其具体的发病机制尚不清楚。

细胞凋亡(apoptosis)是指生物体内绝大多数细胞在一定发育阶段由基因控制的、自主的、有序的死亡过程，它对于自身稳定的维持、组织的进化、器官的发育等起着重要的作用。细胞凋亡机制主要有外源性和内源性途径两种，外源性途径需要先形成凋亡诱导信号复合体(DISC)，然后最终激活Caspase-3，引起细胞凋亡；内源性途径也需要先形成凋亡活化复合体，然后激活Caspase-9 及下游的Caspase-3，最终导致细胞凋亡[7-9]。研究发现，2 型糖尿病大鼠肺组织中Caspase-3和Caspase-9表达增高，罗格列酮可通过调节肺组织中Caspase-3和Caspase-9的表达抑制肺组织细胞凋亡，延缓糖尿病肺病变的进展[10]。本研究发现，与对照组比较，糖尿病组大鼠肺组织Caspase-3与Caspase-9蛋白的表达显著升高，P<0.01，这与先前的研究一致，结果提示，Caspase-3与Caspase-9很可能在糖尿病肺部损害中发挥作用。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)通路是真核细胞关键的信号转导通路，在细胞凋亡、代谢、增殖及分化等生命活动中发挥着重要功能,研究发现，糖尿病肾病大鼠模型的肾皮质中PI3K及Akt活性升高[11]，大鼠糖尿病发病4周后整个肾脏的磷酸化PKB/Akt水平增加，并且体内由Gas6肾脏因子介导的肾小球肥大与PI3K/Akt信号通路有关[12]。本研究组前期研究已经证明，糖尿病模型组大鼠肺组织PI3K、Akt和p-Akt的表达量均显著高于对照组，PI3K/Akt信号通路可能参与了糖尿病肺组织病变的发生发展，但是其具体的作用机制尚不清楚，其是否能够调节炎症因子Caspase-3和Caspase-9的表达都需进一步研究。

本研究通过建立糖尿病大鼠模型，在注射PI3K抑制剂Wortmannin阻断PI3K/Akt信号通路后，采用免疫组织化学和Western 方法检测DM大鼠肺组织中Caspase-3与Caspase-9表达的变化情况，结果发现，与糖尿病组相比，Wortmannin处理组大鼠肺组织炎性因子Caspase-3和Caspase-9的表达显著降低，P<0.01，结果提示，Caspase-3与Caspase-9可能参与了PI3K/Akt信号通路介导的糖尿病肺组织病变的病理机制。血糖、血脂测定结果发现，与糖尿病组相比，Wortmannin处理组大鼠血糖、血脂浓度显著降低，P<0.01，说明阻断PI3K/Akt信号通路后，能够改善血糖、血脂状况。本实验结果的发现有利于阐明PI3K/Akt信号通路参与糖尿病肺损伤的作用机制，能够为糖尿病肺损伤的药物治疗提供一定参考依据。

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The effect of Wortmanninon on the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 in in lung tissue of diabetic rats

LIANGYing-jie,ZHOUDe-peng,CAODong-hua.

(DepartmentofLaboratoryMedicine,theGenerarHospitalofLiaoheOilfield,Panjin124010,China)

ObjectiveTo study the effect of Wortmanninon on the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 in lung tissue of diabetic rats.Methods60 rats were divided into control group(20) diabetes mellitus group(20),and Wortmannin treatment group(20).The diabetic rat models were established by giving high glucose,highfat diet combined with peritoneal injection with low-dose streptozotocin(STZ).The changes of blood glucose,blood lipids and body weight were measured after the establishment of the model of diabetes,the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 were observed by immunohistochemical method and western blot method in lungs of rats in all groups.ResultsCompared with the control group,serum glucose,lipid values were significantly higher in rats of diabetes mellitus group,P<0.01.Compared with the diabetes mellitus group,serum glucose,lipid values were significantly lower in rats of Wortmannin treatment group,P<0.01.Compared with control group,the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 were increased significantly in lung tissue of rats in diabetes mellitus group,P<0.01.Compared with the diabetes mellitus group,the expressions of Caspase-3 and Caspase-9 were decreased significantly in lung tissue of rats in Wortmannin treatment group.ConclusionPI3K/Akt signal pathway might be related to lung tissue pathological changes of dibtetic rats by regulating the expressions of Caspase-3 and Caspase-9.

diabetes mellitus;lung;PI3K;Caspase-3;Caspase-9;rat

辽宁省教育厅科研基金项目(2010687)

1007-4287(2016)09-1428-04

R282.71R587.2

A

2015-10-12)