人参皂苷Rb1对糖氧剥夺所致SH-SY5Y细胞凋亡的影响及机制研究

高　丽，兴芝博，陆　斌，刘　磊,栾永昕*

(1.吉林大学第一医院 a.门诊部;b.神经外科,吉林 长春130021；2.延边大学医学部2013级)



人参皂苷Rb1对糖氧剥夺所致SH-SY5Y细胞凋亡的影响及机制研究

高丽1a，兴芝博2，陆斌1b，刘磊1b,栾永昕1b*

(1.吉林大学第一医院 a.门诊部;b.神经外科,吉林 长春130021；2.延边大学医学部2013级)

目的为了探讨人参皂甙Rb1(GRb1)对糖氧剥夺(OGD)所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及GRb1的保护作用机制。方法采用体外培养SH-SY5Y细胞，应用MTT法、TUNEL染色、流式细胞仪、Western Blotting等方法检测GRb1对糖氧剥夺所致SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用。结果GRb1预处理能增强OGD损伤细胞的生存能力，抑制OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。进一步研究显示GRb1能抑制由OGD线粒体膜电位的降低和线粒体内细胞色素C(cyct C)的释放。结论研究表明GRb1对OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用与其对线粒体功能的保护有关。

人参皂苷Rb1;糖氧剥夺;线粒体;细胞色素c

(ChinJLabDiagn,2016,20:1425)

缺血性中风是导致中老年人致死和致残的主要原因之一。缺血再灌注是导致迟发性神经元损伤或死亡的主要因素。细胞凋亡在各种病理因素引起的神经元细胞凋亡中起重要作用，而抗凋亡可以减轻缺血再灌注引起的神经元细胞损伤。越来越多的证据表明，线粒体是调节细胞凋亡的一个重要的细胞器。在应激条件下，线粒体膜电位去极化，释放线粒体内细胞色素C(cyct C)进而启动了内源性凋亡信号通路[1]。

人参皂苷有抗感染、抗凋亡、诱导神经性能改变等生物学功能，而GRb1可以抑制心、肝、脑细胞缺血再灌注损伤[2-4]。因此，GRb1可能是治疗缺血再灌注引起脑损伤的潜在药物。尽管动物实验表明GRb1能减缓局部缺血再灌注引起的神经元细胞凋亡，但它对线粒体功能的影响依旧不清楚。在本研究中，我们采用SH-SY5Y细胞的OGD模型模拟体内神经元缺血再灌注性损伤，探讨GRb1对SH-SY5Y细胞线粒体的保护作用。

1　材料与方法

1.1试剂

GRb1购自国家药品和生物制品检测所，cyct C、细胞色素氧化酶IV(COX IV)单克隆抗体、山羊抗兔IgG和马抗小鼠IgG购自Cell Signaling公司，ECL购自Amersham公司，PVDF膜购自Millipore公司，DMEM培养基购自Gibco公司。其它试剂均购自Sigma公司。

1.2细胞培养、糖氧剥夺及分组

人SH-SY5Y细胞从中国科学院上海细胞生物学研究所获得。将制备好的SH-SY5Y细胞随机分为以下几组：对照组(正常SH-SYSY细胞常氧培养27 h)，OGD组(细胞糖氧剥夺3 h，然后常氧培养24 h)，OGD+GRb1组(分别用1.0 μmol/ L，10 μmol/ L和100 μmol/ L的GRb1与SH-SY5Y细胞共孵育30 min，糖氧剥夺3 h，然后常氧培养24 h)。

1.3细胞存活实验

用酶标仪测定光吸收值。细胞存活力的变化用各组的光吸收值与正常培养细胞的光吸收值的比值来表示。

1.4TUNEL染色检测细胞凋亡

通过计数带绿色荧光的细胞与带红色荧光的细胞来定量细胞凋亡变化，并表示为TUNEL阳性细胞与总细胞的比率。

1.5细胞内ROS水平测试

用DCFH-DA评价细胞内ROS的平均水平，其用任意单位/mg蛋白质表示，作为对照。

1.6线粒体膜电位检测

用流式细胞仪检测罗丹明123细胞的荧光强度。

1.7差速离心

所收集的细胞经差速离心后将沉淀用裂解液溶解后使用蛋白质测定试剂盒检测各组分的蛋白质含量。

1.8凝胶电泳和Western印迹

等量蛋白经电泳、转膜等过程，用柯达影像分析软件分析光密度。

1.9统计学分析

采用SPSS统计软件进行分析，所有数据表示为平均值±标准差，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1GRb1降低OGD引起的细胞凋亡

图1示，SH-SY5Y细胞存活力在OGD再复氧后24 h下降到68.5%±5.2%。但是，用1.0 μmol/L和10.0 μmol/L的GRb1处理，其存活能力分别上升到82.1%±5.8%(与OGD组相比，P<0.01)，87.3%±6.3%(与OGD组相比,P<0.01)，但100 μmol/L的GRb1对细胞存活没有保护作用。结果表明，1.0-10.0 μmol/L的GRb1对SH-SY5Y细胞存活是有保护作用的，而100 μmol/L的GRb1是没有保护作用。因此1.0-10.0 μmol/L的GRb1被用于后面的实验来研究GRb1对OGD引起的细胞凋亡的保护作用。

2.2GRb1抑制OGD引起的细胞凋亡

TUNEL染色评估细胞凋亡。图2示，OGD组TUNEL染色(绿色)阳性细胞百分率是28.8%±7.1%，显著高于对照组7.8%±1.9%，而当用1.0 μmol/L和10.0 μmol/L的GRb1预处理时其上升的百分率分别减少到20.9%±3.8%(与OGD组相比P<0.05)，12.4%±4.1%(与OGD组相比P<0.01)，因此，TUNEL染色结果表明GRb1可抑制OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

2.3GRb1维持线粒体膜电位

线粒体功能障碍是以线粒体膜的去极化为特征。图3示：OGD使SH-SY5Y细胞膜电位从90.41%降到75.96%。用1.0 μmol/L或10.0 μmol/L的GRb1处理可以抑制线粒体膜电位的下降，并分别维持在81.84%和87.58%，这说明GRb1可以减缓OGD诱导的线粒体膜电位下降。该结果表明GRb1可以保护OGD造成的线粒体损伤。

图1　MTT法检测细胞活力

图2　TUNEL染色和流式细胞仪检测细胞凋亡

图3　流式细胞仪测量线粒体膜电位

2.4GRb1抑制cyct C的释放

线粒体内的cyct C在启动内在的细胞凋亡途径中起重要作用。因此，我们通过差速离心分离亚细胞线粒体和细胞浆，并通过Western Blottting检测线粒体内和细胞内cyct C的含量变化。图4示：同对照组相比较，OGD后线粒体中cyct C水平显著降低，但是细胞浆内的cyct C显著升高。而用1.0 μmol/L或10.0 μmol/L GRb1处理后则抑制了由OGD引起的cyct C的变化，GRb1降低线粒体内cyct C释放，并且减缓其在细胞质内的增加，10.0 μmol/L效果较1.0 μmol/L更显著。该结果提示了GRb1具有抑制线粒体损伤的作用。

图4　Western印迹分析

3　讨论

本研究表明无论是较低浓度(1.0 μmol/L)或是较高浓度(10.0 μmol/L)的GRb1都通过抑制细胞凋亡而显著地减少OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，而且我们发现，GRb1的抗凋亡作用与其降低线粒体膜电位、防止cyct C从线粒体释放等保护线粒体功能有关。这些结果表明GRb1对OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用是通过稳定线粒体功能来完成的。

OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡常被用来模仿由脑缺血再灌注引起的神经元细胞凋亡[5]。预防或抑制细胞凋亡已成为保护神经元细胞的一种策略。GRb1通过多种途径在细胞凋亡过程中起保护作用[2]。线粒体是公认的介导细胞凋亡至关重要的细胞器。越来越多的证据表明稳定线粒体可以发挥其神经元细胞凋亡的保护作用。Liang等人报道对由缺血再灌注引起的大脑损伤可以通过稳定线粒体功能进行缺血性后处理保护[6]。Jiang等人用帕金森病大鼠模型研究神经元细胞凋亡过程中雷帕毒素的保护作用，发现这与稳定线粒体功能有关[7]。诸实验均表明稳定线粒体功能是减少神经元细胞凋亡的一种途径。

线粒体不仅是细胞内活性氧的主要来源，而且也是活性氧攻击目标。活性氧的攻击可导致线粒体膜电位的衰减，膜电位是反映线粒体功能的指示器。因此，在本研究中我们检测SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的变化。我们发现用GRb1预处理能显著将线粒体膜电位维持在一个较高的水平。Kong等人证明了GRb1通过抑制线粒体通透性转换孔开放，防止新生大鼠氯化钴诱导的心肌细胞凋亡[8]。我们的结论和先前的研究均表明GRb1对细胞凋亡的抑制作用与其保护线粒体功能有关。

cyct C从线粒体释放反映出线粒体功能障碍。在本研究中，我们证实GRb1可以有效地抑制cyct C由线粒体释放。该结果与缺血模型中抗氧化剂可以抑制凋亡诱导因子和cyct C的释放一致[9]。抑制cyct C的释放表明GRb1预处理可以保护线粒体功能并抑制胱天蛋白酶依赖和胱天蛋白酶非依赖途径的激活。Hashimoto等人证明GRb1通过刺激雌激素受体与ERK1/2，Akt的后续活化和抑制SAPK/ JNK，p38蛋白的活性减弱MPP+(1-甲基1-4-苯基吡啶)诱导的PC12细胞凋亡。因此，这些先前的研究都表明，GRb1可以通过多种途径发挥抗凋亡作用

在本研究中，我们证明GRb1通过调节线粒体功能，包括维持线粒体膜电位、抑制凋亡诱导因子向细胞核移位和cyct C向细胞质移位、提高线粒体内抗凋亡蛋白Bcl-2水平和降低促凋亡蛋白 Bax水平来抑制细胞凋亡。这些可能有助于我们理解GRb1抗凋亡作用的机制。

[1]Jordan J,de Groot PW,Galindo MF.Mitochondria:the headquarters in ischemia-induced neuronal death[J].Cent Nerv Syst Agents Med Chem，2011,11(2):98.

[2]Wu Y,Xia ZY,Dou J，et al.Protective effect of ginsenoside Rb1 against myocardial ischemia/reperfusion injury in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Mol Biol Rep，2011,38(7):4327.

[3]Guo Y,Yang T,Lu J，et al.Rb1 postconditioning attenuates liver warm ischemia-reperfusion injury through ROS-NO-HIF pathway[J].Life Sci，2011,88(13-14):598.

[4]Lim JH,Wen TC,Matsuda S，et al.Protection of ischemic hippocampal neurons by ginsenoside Rb1,a main ingredient of ginseng root[J].Neurosci Res，1997,28(3):191.

[5]Marutani E,Kosugi S,Tokuda K，et al.A novel hydrogen sulfide-releasing N-methyl-D-aspartate receptor antagonist prevents ischemic neuronal death[J].J Biol Chem，2012,287(38):32124.

[6]Liang JM,Xu HY,Zhang XJ，et al.Role of mitochondrial function in the protective effects of ischaemic postconditioning on ischaemia/reperfusion cerebral damage[J].J Int Med Res，2013,41(3):618.

[7]Jiang J,Jiang J,Zuo Y，et al.Rapamycin protects the mitochondria against oxidative stress and apoptosis in a rat model of Parkinson's disease[J].Int J Mol Med，2013,31(4):825.

[8]Kim GS,Jung JE,Narasimhan P，et al.Release of mitochondrial apoptogenic factors and cell death are mediated by CK2 and NADPH oxidase[J].J Cereb Blood Flow Metab,2012,32(4):720.

[9]James D,Parone PA,Terradillos O，et al.Mechanisms of mitochondrial outer membrane permeabilization[J].Novartis Found Symp,2007,287:170.

Ginsenoside Rb1 attenuates oxygen-glucose deprivation-induced apoptosis in SH-SY5Y cells via protection of mitochondria

GAOLi,XINGZhi-bo,LUBin,etal.

(DepartmentofPoliclinic,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the role of mitochondria in the protective effects of ginsenoside Rb1 on cellular apoptosis caused by oxygen-glucose deprivation.Methodsin this study,MTT assay,TUNEL staining,flow cytometry,immunocytochemistry and western blotting were used to examine the cellular viability.ResultsWe found that pretreatment with GRb1 improved the cellular viability damaged by OGD.Moreover,GRb1 inhibited apoptosis in SH-SY5Y cells induced by OGD.Further studies showed that the elevation of cellular reactive oxygen species levels and the reduction of mitochondrial membrane potential caused by OGD were both counteracted by GRb1.ConclusionOur study indicates that the protection of GRb1 on OGD-induced apoptosis in SH-SY5Y cells is associated with its protection on mitochondrial function and inhibition of release of AIF and cytochrome c.

ginsenoside Rb1;oxygen-glucose deprivation;mitochondria;cytochrome c

1007-4287(2016)09-1425-04

R392R743.3

A

2015-04-19)