小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖的保护作用

曹小舟,陈海娟,刘永祥,宁钧宇,沈新春,*

(1.南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,江苏南京 210023;2.北京市疾病预防控制中心,北京 100013)



小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖的保护作用

曹小舟1,陈海娟1,刘永祥1,宁钧宇2,沈新春1,*

(1.南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,江苏南京 210023;2.北京市疾病预防控制中心,北京 100013)

目的:研究小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的保护作用。方法:用高糖诱导的VSMCs模型,将培养的VSMCs随机分为三大组:正常组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖,G)和实验组(25 mmol/L葡萄糖+不同浓度的抗氧化肽)。采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)快速比色法和流式细胞仪检测抗氧化肽对VSMCs增殖活性及其细胞周期分布影响;通过酶标法测定在不同处理条件下细胞内总抗氧化能力(total antioxidation capacity,T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量变化。结果:小麦胚芽抗氧化肽可有效抑制高糖诱导的VSMCs增殖(p<0.01),阻滞细胞周期G1/S期转换,显著提高了细胞中总抗氧化能力,GSH-Px和SOD酶水平(p<0.01),降低了细胞中MDA水平(p<0.01)。结论:小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的VSMCs增殖具有明显的保护作用。

小麦胚芽抗氧化肽,血管平滑肌细胞,高糖,保护作用

小麦胚芽,又称胚芽、麦芽粉,约占小麦籽粒的2%～3%,是整个麦粒营养价值最高的部分,富含丰富的B族维生素、VE、不饱和脂肪酸、赖氨酸、膳食纤维和一些具有功能性的微量元素[1-2]。脱脂后的小麦胚芽蛋白质含量约为30%,它由清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白等组成。其中,清蛋白含量最高约占总蛋白的34.4%,必需氨基酸组成十分合理,含有人体必需的8种氨基酸,是一种优质的蛋白质,蕴藏着许多具有生物活性的氨基酸序列,已被作为天然营养源应用于食品加工中[3-4]。近年来,许多研究者发现[5-8]麦胚蛋白酶解产物在DPPH自由基清除能力、Fe2+螯合能力、抑制脂质过氧化能力等多种体外抗氧化体系中均表现出很高的活性,还有很多研究通过建立细胞氧化应激模型[9-10]和小鼠动物模型[11]证实了麦胚蛋白酶解产物体内的抗氧化活性。

动脉粥样硬化是一种炎性血管病变,是心血管疾病的主要病理基础。血管壁的重要构成成分是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs),位于血管中层及内膜。动物实验和临床资料表明,VSMCs的异常增殖是引起动脉粥样硬化的细胞学基础[12-14]。因此,VSMCs的体外培养已成为研究细胞生物学与多种疾病之间关系的重要方法。本实验采用体外培养VSMCs,用高糖刺激VSMCs异常增殖,建立VSMCs增殖模型,从细胞增殖率、抗氧化酶系和细胞周期等不同方面来探究小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的VSMCs增殖的保护作用,旨在确证小麦胚芽抗氧化肽在细胞水平的生物抗氧化性,这将为小麦胚芽抗氧化肽开发成抗氧化功能性食品或功能因子提供重要的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

小麦胚芽抗氧化肽生工生物工程(上海)股份有限公司制备,纯度95%以上;血管平滑肌细胞(VSMCs)北京疾控中心;胎牛血清、DMEM培养基、Penicillin-Streptomycin(100×)、Trypsin EDTA(0.05%)Gibco公司;噻唑蓝(MTT)、45%葡萄糖Sigma公司;异丙醇、NP-40、盐酸、PBS缓冲液、无水乙醇国药集团化学试剂有限公司;总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒、超氧化物酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、微量蛋白含量测定(BCA法)试剂盒南京建成生物工程研究所;RIPA细胞裂解液、细胞周期检测试剂盒碧云天生物试剂公司;其他试剂均为国产分析纯。

Spectra Max多功能酶标仪美国Bio Tek公司;生物安全柜、CO2培养箱、SL16R台式冷冻离心机美国Thermo Fisher公司;WH-2微型漩涡混合仪上海沪西分析仪器厂有限公司;荧光倒置显微镜卡尔·蔡司公司;HH-2数显恒温水浴锅国华电器有限公司;流式细胞仪Accuri C6美国BD公司;JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎仪宁波新艺超声设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1小麦胚芽抗氧化肽的制备小麦胚芽抗氧化肽Ala-Arg-Glu-Gly-Glu-Thr-Val-Val-Pro-Gly(AREGETVVPG,1014.46 Da)[15]委托生工生物工程(上海)股份有限公司用化学法合成(纯度95%以上),作为本研究用的小麦胚芽抗氧化肽样品。

1.2.2细胞传代培养及分组细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁生长,用0.05%的胰酶消化传代,取对数生长期的细胞,接种于细胞培养皿中,培养48 h后,弃培养液,随机分为三大组:正常组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖,G)和实验组(25 mmol/L葡萄糖+不同浓度的抗氧化肽)。

1.2.3噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖取对数生长期的VSMCs,用0.05% EDTA-胰蛋白酶溶液消化后,用含2% FBS的DMEM培养液将细胞悬液调至5×104个/mL,接种于96孔板,每孔100 μL,细胞数目为5×103个/孔,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养48 h。按1.2.2进行分组处理,继续培养24 h,每孔加入10 μL 5 mg/mL的MTT溶液(PBS溶液配制,过0.22 μm无菌膜除菌),继续培养4 h后;弃上清加入100 μL异丙醇溶解液,37 ℃恒温振荡器中避光反应15 min后,在酶标仪于波长570 nm处测定A[16]。细胞增殖率(%)=[(As-A0)/(An-A0)]×100,其中,As为待测样品组,An为正常对照组,A0为空白对照组。

1.2.4细胞总抗氧化能力(T-AOC)、抗氧化酶活性(SOD、GSH-Px)和MDA的检测取对数生长期的VSMCs,用0.05% EDTA-胰蛋白酶溶液消化后,用含10% FBS的DMEM培养液将细胞悬液调至1×105个/mL,接种于24孔板,每孔500 μL,使细胞数目为5×104/孔,待细胞完全贴壁后,换用不含血清的DMEM培养液培养24 h,使细胞同步于G0期。按1.2.2进行分组处理,继续培养48 h。然后除去培养液,各孔加入200 μL细胞裂解液,冰上裂解细胞15 min后,冰水浴条件下超声波破碎(功率300 W,3～5 s/次,间隔10 s,重复3次)吸取各组细胞匀浆液,按照试剂盒说明书分别测定T-AOC、SOD、GSH-Px的活力和细胞MDA的含量。酶活表示为U/mg蛋白。

1.2.5流式细胞仪测定细胞周期分布取对数生长期的VSMCs,用0.05% EDTA-胰蛋白酶溶液消化后,用含10% FBS的DMEM培养液将细胞悬液调至1×105个/mL,接种于6孔板,每孔2 mL,使细胞数目为2×105/孔,待细胞完全贴壁后,换用不含血清的DMEM培养液培养24 h,使细胞同步于G0期。按1.2.2进行分组处理,孵育48 h后,弃培养液,PBS洗涤后以0.05% EDTA-胰蛋白酶溶液消化收集细胞。PBS洗涤2次,70%冷乙醇固定,4 ℃过夜。将细胞悬液1000 r/min离心5 min,弃乙醇,PBS洗涤两次,弃上清液,沉淀加入碘化丙啶染色液500 μL(PI 50 μg/mL,RNase A 20 μg/mL),37 ℃避光染色30 min,流式细胞仪上测定细胞周期分布,并按公式增殖指数(Proliferation index,%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)(100计算细胞增殖指数PI[17-18]。

1.2.6统计学分析每组实验至少重复3次,实验结果用平均数±标准差表示,采用Origin 7.5绘图软件绘图,JMP 10.0统计软件进行t检测。p<0.05代表差异具有显著性,p<0.01代表差异具有高度显著性。

2　结果与分析

2.1小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的VSMCs增殖的影响

不同浓度的小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的VSMCs增殖的影响如表1所示。以正常组作为对照组,高糖能明显促进VSMCs增殖,细胞数量高出对照组42.58%(p<0.01)。经过5、10、20、30和40 μg/mL的抗氧化肽孵育24 h后,细胞增殖率分别下降至138.93%、132.64%、122.55%、104.08%和103.95%。当抗氧化肽的浓度为30、40 μg/mL时,VSMCs增殖率降几乎达到了和正常组一致的水平。实验结果表明,一定浓度的小麦胚芽抗氧化肽可以保护细胞,有效抑制高糖引起的VSMCs增殖过快。

表1　不同浓度小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的VSMCs增殖的影响

注:##:与正常组相比有高度差异(p<0.01);*:与高糖组相比有显著差异(p<0.05);**:与高糖组相比有高度差异(p<0.01)。

表2所示为不同浓度的小麦胚芽抗氧化肽对正常糖孵育的VSMCs生长的影响。结果显示,在5、10、20、30 μg/mL的浓度条件下,抗氧化肽对正常糖孵育的VSMCs生长状态无任何不良影响,表明低浓度的抗氧化肽对细胞没有任何毒性(p>0.05)。当抗氧化肽的浓度为40 μg/mL时,细胞的存活率降到了95.56%(p<0.05),表明此浓度的抗氧化肽对细胞具有一定的毒性。

表2　 不同浓度小麦胚芽抗氧化肽对正常糖孵育的VSMCs存活率的影响

注:*:与0 μg/mL相比存活率有显著差异(p<0.05)。

2.2小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的VSMCs总抗氧化能力(T-AOC)的影响

T-AOC包括酶与非酶在内的全部抗氧化物,是一个能够全面反映抗氧化能力的指标。由图1可知,经过25 mmol/L的葡萄糖处理后,VSMCs中的T-AOC与正常组相比有显著的降低(p<0.01)。低浓度的抗氧化肽具有一定的提高T-AOC的作用,但效果不明显(p>0.05)。与高糖组相比,加入10 μg/mL和30 μg/mL的小麦胚芽抗氧化肽后,VSMCs中的T-AOC分别提高了59.22%和81.47%(p<0.01)。表明小麦胚芽抗氧化肽可以通过提高抗氧化能力来保护细胞。

图1　小麦胚芽抗氧化肽对VSMCs中T-AOC水平的影响Fig.1　Effects of wheat germ AOP on T-AOC content in VSMCs 注:G:高糖(下同);##:与正常组相比有高度差异(p<0.01);*:与高糖组相比有显著差异(p<0.05);**:与高糖组相比有高度差异(p<0.01),图2、图3、图5同。

2.3小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的VSMCs中GSH-Px和SOD酶水平的影响

自由基对细胞的损伤包括:过剩的自由基攻击细胞,使质膜中的不饱和脂肪酸氧化,从而破坏细胞的膜结构,使膜功能失常,导致细胞死亡;使DNA链断裂、交联;抑制核酸的生物合成等[19]。在氧化应激状态下,机体自身的抗氧化防御系统通过酶促(谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT)与非酶促(维生素、氨基酸和金属蛋白)两个作用体系来清除过多的自由基,维持机体的平衡状态[20]。Ryu等[21]对海藻多肽抗氧化作用的研究中,通过分析GSH-Px、SOD等指标的变化来评价海藻多肽对氧化损伤细胞的保护作用;范金波等[22]通过建立过氧化氢诱导损伤人脐静脉内皮细胞(ECV-304)模型,测定了抗氧化酶系,如SOD、CAT、GSH-Px酶的水平,确证了丝胶抗氧化肽在细胞水平的生物抗氧化功能。因此,本研究通过测定各实验组VSMCs的GSH-Px和SOD活性水平,进一步分析小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的VSMCs的抗氧化作用。

由图2可知,正常组VSMCs中的抗氧化酶GSH-Px和SOD活性均在较高的水平,经25 mmol/L的葡萄糖处理48 h后,高糖组细胞中的GSH-Px和SOD活性分别降低至106.04 U/mg蛋白和113.38 U/mg蛋白(p<0.01)。同高糖组相比,各实验组细胞中GSH-Px和SOD的活性随着抗氧化肽浓度的升高,酶活性均有不同程度的提高。相比高糖组的GSH-Px活力,5、10、30 μg/mL抗氧化肽组分别提高了10.30%、16.44%和28.30%;相比高糖组的SOD活力,5、10、30 μg/mL抗氧化肽组分别提高了8.36%、20.79%和34.46%。统计分析表明,10 μg/mL和30 μg/mL实验组的GSH-Px和SOD酶活性均极显著高于高糖组(p<0.01)。

图2　小麦胚芽抗氧化肽对VSMCs中GSH-Px(a)和SOD(b)酶水平的影响Fig.2　Effects of wheat germ AOP on GSH-Px(a)and SOD(b)activities in VSMCs

为对抗氧化应激引起的各种损伤,有氧生物在进化过程中发展了多种抗氧化防御机制[23]。作为生物防御体系的关键酶,GSH-Px和SOD能够清除外源性产生的活性氧,减轻自由基对细胞的攻击,其活力的变化可间接的反映细胞受损的情况及修复能力的强弱[24]。本实验结果表明,小麦胚芽抗氧化肽可能是通过增加机体清除自由基的能力来减轻氧化应激,从而维持细胞的稳定状态,发挥保护细胞的功能。

2.4抗氧化肽对高糖诱导的VSMCs中MDA水平的影响

作为氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化反应的最终产物,细胞的受损程度可由细胞内MDA的含量间接反映[25]。各组细胞的MDA含量见图3。高糖组的MDA含量与正常组相比显著升高(p<0.01),说明高糖环境使质膜脂质过氧化而积累大量产物MDA。抗氧化肽的添加,能显著降低细胞内MDA的含量。统计分析表明,10 μg/mL和30 μg/mL的抗氧化肽对细胞中的MDA具有极显著的清除作用,分别降低了21.94%和38.71%(p<0.01)。结果表明小麦胚芽抗氧化肽可以通过减少脂质过氧化反应和脂质过氧化产物的生成发挥其抗氧化作用。

图3　小麦胚芽抗氧化肽对VSMCs中MDA水平的影响Fig. 3　Effects of wheat germ AOP on MDA content in VSMCs

2.5小麦胚芽抗氧化肽对高糖诱导的VSMCs细胞周期的影响

细胞周期是指以有丝分裂方式增殖的细胞从亲代分裂结束到子细胞分裂结束所经历的过程。处于增殖周期的正常细胞,其所处的不同细胞周期(G0/G1期、S期、G2/M期)DNA含量也不同,相比G0/G1期,处于G2/M期的细胞DNA含量增加一倍,处于S期的细胞DNA含量介于两者之间[26]。

如图4所示,经25 mmol/L的葡萄糖刺激诱导后,高糖组b图中G0/G1期细胞数分别由正常组a图中的77.35%减少到64.73%,而处于S期的细胞数则由正常组的6.15%增加到20.23%,说明高糖环境可以促进细胞从G0/G1期进入S期。加入不同浓度(10 μg/mL和30 μg/mL)的小麦胚芽抗氧化肽后,实验组被阻滞于G0/G1期的细胞上升至70.73%和74.78%,而S期的细胞数目减少到14.03%和8.58%。进一步计算细胞增殖指数,结果如图5所示,加入25 mmol/L的葡萄糖后,增殖指数由正常组的22.65%增加到高糖组的35.27%(p<0.01),加入抗氧化肽(10 μg/mL和30 μg/mL)孵育48 h后,高糖诱导的细胞增殖指数降至29.27%和25.22%(p<0.01)。实验结果表明小麦胚芽抗氧化肽主要是抑制高糖诱导的G0/G1期细胞进入S期,从而抑制细胞增殖的进程。

图4　各组细胞DNA流式图Fig.4　The DNA content by flow cytometry注:a.正常组;b.高糖组;c.10 μg/mL抗氧化肽实验组;d.30 μg/mL抗氧化肽实验组。

图5　小麦胚芽抗氧化肽对VSMCs周期的影响Fig.5　Effects of wheat germ AOP on cell cycle

3　结论

通过建立高糖诱导的VSMCs模型,研究小麦胚芽抗氧化肽对细胞抗氧化酶系水平、中间产物水平和细胞周期的影响,评价其对细胞的保护作用。实验结果表明:小麦胚芽抗氧化肽可以显著提高高糖诱导的VSMCs中T-AOC、GSH-Px和SOD酶活性,降低MDA含量,阻滞细胞周期G1/S期转换,进而抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖。这些数据均表明小麦胚芽抗氧化肽具有良好的抗氧化活性,可以作为一种功能性食品添加剂应用于食品工业,其机制可能与增加机体清除自由基的能力和保护细胞膜的脂质过氧化有关,其详细机理有待进一步研究。

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Protective effects of wheat germ antioxidant peptide on proliferation of vascular smooth muscle cells exposed to high glucose

CAO Xiao-zhou1,CHEN Hai-juan1,LIU Yong-xiang1,NING Jun-yu2,SHEN Xin-chun1,*

(1.College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China; 2.Beijing Center for Diseases Control and Prevention,Beijing 100013,China)

Objective:To evaluate the protective effects of wheat germ antioxidant peptide(AOP)on proliferation of vascular smooth muscle cells(VSMCs)exposed to high glucose. Methods:VSMCs were randomly divided into 3 groups,normal control group(5.5 mmol/L glucose),model control group(25 mmol/L glucose)and treatment groups(25 mmol/L glucose in different concentration of AOP). MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)assays were used to measure VSMCs proliferation,cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. The activities of total antioxidation capacity(T-AOC),glutathione peroxidase(GSH-Px),superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results:VSMCs proliferation that was enhanced by high glucose was effectively suppressed by wheat germ AOP(p<0.01),and the cell cycle G1/S phase transition was also blocked. In addition,antioxidative enzyme(T-AOC,GSH-Px and SOD)activities in VSMCs exposed to high glucose were significantly increased in the presence of AOP(p<0.01),whereas the MDA level was decreased(p<0.01). Conclusion:These results indicated that wheat germ AOP exhibited significant protective effects on proliferation of VSMCs exposed to high glucose.

wheat germ antioxidant peptides(AOP);vascular smooth muscle cells(VSMCs);high glucose;protective effects

2016-03-03

曹小舟(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：农产品深加工与副产品综合利用，E-mail：15951912672@163.com。

沈新春(1966-)，男，博士，教授，研究方向：农产品深加工与副产品综合利用、分子营养， E-mail：shenxinchun@njue.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31271983、81170268)；江苏省自然科学基金 (BK20141484)；江苏省高校自然科学研究重大项目(14KJA550002)；2015年度江苏省高校优秀科技创新团队、江苏高校优势学科建设工程资助项目。

TS213.2

A

1002-0306(2016)17-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.001