溴结构蛋白4在食管鳞癌中的表达及JQ-1对其活性的抑制作用

吴　丹　吕　望　虞　莉　周振宇　胡耶基　胡　坚

(浙江大学医学院附属第一医院，浙江　杭州　310006)



溴结构蛋白4在食管鳞癌中的表达及JQ-1对其活性的抑制作用

吴丹吕望虞莉周振宇胡耶基胡坚

(浙江大学医学院附属第一医院，浙江杭州310006)

目的探讨溴结构蛋白(BRD)4在食管鳞癌中的表达特征及靶向抑制内源性BRD4的活性对食管鳞癌细胞增殖的影响及作用机制。方法免疫组化染色检测80例食管鳞癌和配对癌旁组织中BRD4的表达情况，分析BRD4的表达与临床病理特征的关系，分析其在预后评估中的价值。小分子抑制剂JQ-1作用于食管鳞癌细胞EC109，MTT分析抑制内源性BRD4的活性对细胞增殖的影响；流式细胞术分析JQ-1干预对细胞凋亡的影响；Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白表达的变化。结果BRD4阳性表达于细胞质和细胞核，癌组织较癌旁组织表达显著增高；BRD4的表达与食管鳞癌的分化程度、淋巴结转移和病理分期显著相关(P<0.01)，BRD4高表达的患者预后不良。JQ-1显著抑制食管鳞癌细胞的增殖；JQ-1干预24 h，EC109细胞的凋亡率显著上升；细胞凋亡执行蛋白cleaved-caspase3和cleaved-PARP1表达显著上调。结论BRD的表达与食管鳞癌疾病进展明确相关，是潜在的预后评估标记物；抑制内源性BRD的活性通过诱导细胞凋亡抑制食管鳞癌细胞的增殖。因此，BRD4是潜在的食管鳞癌治疗靶点。

食管鳞癌；溴结构蛋白(BRD)4

食管癌居我国癌症死亡率第四位，每年新发病例超过25万〔1〕。我国食管癌的主要病理类型是鳞癌，因食管鳞癌恶性程度高、病程进展迅速、易复发转移，患者总体预后仍然较差〔2〕。溴结构蛋白(BRD)4是box基因家族转录因子(BET)家族的一员，含有两个溴结构域和一个超末端结构〔3〕。近来研究发现，BRD4表达的失调或功能紊乱与黑色素瘤、急性髓系白血病、结肠癌、乳腺癌等肿瘤的发生有关，BRD4 shRNA或BET抑制剂可以诱导肿瘤细胞发生周期阻滞、凋亡或分化，显示出强大的抗肿瘤活性〔4～6〕。这些研究表明，BRD4有望成为肿瘤治疗的新靶点。本研究探讨BRD4在食管鳞癌中的表达情况及小分子抑制剂JQ-1对食管鳞癌细胞内源性BRD4活性的抑制作用。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1一般资料选取2006年1月至2015年12月慈溪市人民医院经手术切除的80例Ⅰ～Ⅲ期(AJCC 2009年版)食管鳞癌患者，Ⅰ期6例、Ⅱ期38例、Ⅲ期36例，年龄48～82岁，平均年龄64.7岁。所有病例术前均未行放化疗，无其他肿瘤史，临床及病理资料完整；癌旁组织选择距癌组织边缘>5 cm处，所有标本经10%中性甲醛固定，常规脱水后石蜡包埋，每例病理切片均经两位病理医师确诊。术后开始随访，截止于2015年12月，失访5例，随访率为93.4%。

1.1.2药物和细胞株JQ-1购自Selleckchem公司(纯度≥98%)；用二甲基亚砜(DMSO)配成50 mmol/L的母液，-20℃保存，使用时用培养液稀释至目标浓度。人食管鳞癌细胞EC109购自中国科学院细胞库。

1.1.3试剂胎牛血清、DMEM培养液、0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)购自CORNING公司；噻唑蓝(MTT)、牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自BD Pharmingen公司；兔抗人BRD4、cleaved-caspase3、cleaved-PARP1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体均购自为Abcam公司产品；免疫组化检测试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购自DAKO公司；电化学发光法(ECL)发光试剂购自Bio-Rad公司。

1.1.4主要仪器石蜡切片机(Thermo公司)，病理组织烘漂处理仪(Thermo公司)，BX41光学显微镜(OLYMPUS公司)，显微成像系统(OLYMPUS公司)，细胞培养箱(Thermo公司)，iMARK酶标仪(Bio-Rad公司)，CytoFLEX流式细胞仪(Beckman公司)，垂直电泳及蛋白转膜装置(Bio-Rad公司)，凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。

1.2实验方法

1.2.1免疫组化染色分析食管组织BRD4蛋白的表达石蜡切片在60℃烤箱中烤2 h，经脱蜡、水化、抗原修复、3%羊血清封闭后，加兔抗人BRD4多克隆抗体(1∶2 000稀释)，室温孵育2 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗片后加生物素化的二抗及链霉亲合素-生物素-过氧化物酶(SABC)复合物，室温反应30 min，洗片后DAB显色，苏木素复染，经脱水、透明、封片，显微镜下观察组织染色情况并拍照。结果判断：阳性定位，BRD4蛋白主要表达于细胞质和细胞核，呈棕黄色颗粒。定性：在切片中染为淡黄色至棕黄色作为阳性标志；将阳性细胞数分为4类：(-)为阳性细胞<1%；(+)为阳性细胞占1%～24%；()为阳性细胞占25%～50%；()为阳性细胞>50%；综合染色强度和阳性细胞数判定食管组织BRD4蛋白高表达和低表达。

1.2.2细胞培养EC109细胞以含10%胎牛血清的DMEM完全培养液，培养于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。

1.2.3MTT实验分析JQ-1的细胞毒作用EC109细胞按每孔1×104个接种于96孔培养板，细胞贴壁后弃去上清，加入100 μl含20、40、80和120 μmol/L JQ-1的含药培养液，每组设3个复孔，空白对照组加入等体积的完全培养液。药物作用24 h，MTT法分析JQ-1对细胞生长的影响，酶标仪测定各孔490 nm处吸光度值(A)，计算细胞存活率(%)，实验重复3次。

1.2.4流式细胞术检测凋亡率EC109细胞以每孔3×105个细胞接种于6孔板。细胞贴壁后，实验组加入40、80、120 μmol/L浓度的含药培养液，空白对照组加入等体积的完全培养液。JQ-1作用24 h，收集各组细胞，取100 μl单细胞悬液，加入Annexin V-FITC(5 μl)和PI(10 μl)混匀，室温避光孵育15 min，加入400 μl 1×结合缓冲液，上机检测细胞凋亡率。

1.2.5Western印迹检测凋亡相关蛋白的表达细胞培养及药物处理同1.2.4。提取JQ-1作用24 h的各组细胞总蛋白，DC法测定蛋白质浓度。取各实验组20 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝胶-十二烷基硫酸钠(PAGE-SDS)电泳，250 mA恒流电转移至PVDF膜。10%脱脂奶粉溶液封闭1 h，多克隆抗cleaved-caspase3、cleaved-PARP1和GAPDH抗体(1∶1 000)室温孵育2 h，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，HRP标记的羊抗兔IgG抗体室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜。滴加ECL试剂于凝胶成像系统内曝光，分析目的蛋白的表达。

1.3统计学方法应用SPSS20.0软件，采用χ2检验分析BRD4的表达情况与临床病理特征的关系，单因素分析采用Kaplan-Meier法，组间比较用Log-rank检验，其他计量资料采用t检验。

2　结　果

2.1食管鳞癌组织和癌旁组织中BRD4的表达情况80例食管鳞癌组织BRD4高表达34例(42.5%)，癌旁组织BRD4高表达有16例(20.0%)，两者比较差异显著(P<0.01)。见图1。

2.2BRD4在食管鳞癌组织中的表达与临床特征的关系BRD4的表达与年龄、性别和T分期无相关性(P>0.05)，与食管鳞癌的分化程度、N分期和病理分期密切相关(P<0.05)。见表1。

图1　食管鳞癌和癌旁组织BRD4表达(DAB，×200)

临床病理特征n高表达低表达χ2值P值年龄(岁) <653615210.0190.892 ≥65441925性别 男5624320.0100.921 女241014分化程度 中-高分化5719386.8170.009 低分化23158T分期 T1,T2153123.8250.051 T3,T4653134N分期 N04212307.0200.008 N1,N2,N3382216病理分期 Ⅰ,Ⅱ4613338.9800.003 Ⅲ342113

2.3BRD4在食管鳞癌组织中的表达与预后的关系34例BRD4高表达的患者1年累积生存率为73.5%，3年累积生存率为11.8%，5年累积生存率为8.8%；46例BRD4低表达的患者1年累积生存率为78.3%，3年累积生存率为50.0%，5年累积生存率为34.8%；BRD4蛋白低表达组的5年生存率明显高于高表达组(P=0.001)。Kaplan-Meier单因素分析提示，BRD4表达、淋巴结是否转移、T分期和病理分期是影响总生存预后的独立因素(P<0.05)，见图2。

图2　不同BRD4蛋白表达食管鳞癌患者的积累生存率比较

2.4JQ-1抑制食管鳞癌细胞EC109的增殖不同浓度的JQ-1干预细胞24 h，明显抑制EC109细胞的增殖，呈剂量依赖关系。空白对照组设为1，20、40、80、120 μmol/L JQ-1组EC109细胞增殖率分别为(101.5±6.5)%、(87.2±5.2)%、(42.3±4.8)%、(5.6±2.2)%。

2.5JQ-1诱导食管鳞癌细胞凋亡JQ-1作用24 h，EC109细胞凋亡率(含早期凋亡和晚期凋亡)与空白对照组〔(2.6±4.5)%〕相比显著上升(P<0.01)，40、80、120 μmol/L JQ-1组凋亡率分别为(8.1±5.2)%，(49.7±6.3)%，(99.7±1.0)%。

2.6JQ-1上调食管鳞癌细胞表达凋亡相关蛋白JQ-1干预24 h，EC109细胞表达caspase3和PARP1的剪切活化片段cleaved-caspase3和cleaved-PARP1显著增加。见图3。

图3　JQ-1促进EC109细胞表达凋亡相关蛋白

3　讨　论

BRD4蛋白是BET家族的一员，bromodomain蛋白BET通过与乙酰化的赖氨酸结合，参与胞核大分子的装配及与染色质的结合，调节DNA的复制、DNA损伤修复、染色质重塑和基因转录等过程〔7〕。最新研究证实，BRD4的表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关〔4～6〕。Liao等〔8〕报道，BRD4的表达与非小细胞肺癌的组织学分型、分化程度、淋巴结转移和病理分期相关，与患者的预后不良相关。Yan等〔9〕发现，BRD4的表达与膀胱尿路上皮癌(UCB)的分化程度、淋巴结转移和远处转移相关，是UCS的一个独立预后因素。目前，BRD4蛋白在食管鳞癌预后预测中的价值未见报道，本研究发现BRD4作为生物标记物在食管鳞癌中具有重要的临床预测价值。由于本研究的样本量偏少，期待今后的研究能够增加样本量，以获得更有说服力的结果。

BET抑制剂具有诱导肿瘤细胞周期阻滞、凋亡以及细胞分化的作用，显示出强大的抗肿瘤活性〔5〕。本文发现，BRD4抑制

剂JQ-1抑制食管鳞癌细胞EC109的增殖；JQ-1作用24 h，实验组细胞凋亡率和凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-PARP1表达水平均显著增高。在凋亡信号传递过程中，caspase3处于信号通路的枢纽位置，具有执行细胞凋亡的功能。酶原形式的caspase3被剪切成17 kD/19 kD的活性二聚体，进而将底物PARP1水解成89和24 kD的片段，使其失去修复DNA损伤的功能，导致受PARP1负调控的核酸内切酶活性增高，降解核小体DNA引起凋亡〔10〕。本研究提示，抑制内源性BRD的活性通过诱导细胞凋亡抑制食管鳞癌细胞的增殖，因此，BRD4是潜在的食管鳞癌治疗靶点。

近来研究发现，BRD4的bromodomain Ⅱ可与双乙酰化的Twist(Twist K73ac/K76ac)结合，同时BRD4的bromodomain Ⅰ与组蛋白H4 K5ac/K8ac结合，从而在Wnt5a的启动子和增强子上形成Twist/BRD4/P-TEFb/RNA-Pol Ⅱ复合物激活其转录；促进基底样乳腺癌(BLBC)细胞上皮间质转化(EMT)和侵袭性生长〔11〕。BRD4是否具有介导食管鳞癌获得EMT表型的功能，JQ-1靶向抑制BRD4的活性是否具有抑制食管鳞癌侵袭转移的作用效应有待进一步研究。

1Chen W,Zheng R,Baade PD,etal.Cancer statistics in China,2015〔J〕.CA Cancer J Clin,2016;66(2):115-32.

2Wei WQ,Chen ZF,He YT,etal.Long-term follow-up of a Community Assignment,one-time endoscopic screening study of esophageal cancer in China〔J〕.J Clin Oncol,2015;33(17):1951-7.

3Devaiah BN,Singer DS.Two faces of brd4:mitotic bookmark and transcriptional lynchpin〔J〕.Transcription,2013;4(1):13-7.

4Fu LL,Tian M,Li X,etal.Inhibition of BET bromodomains as a therapeutic strategy for cancer drug discovery〔J〕.Oncotarget,2015,6(8):5501- 16.

5Roti G,Stegmaier K.New approaches to target T-ALL〔J〕.Front Oncol,2014;2014:4170.

6De Raedt T,Beert E,Pasmant E,etal.PRC2 loss amplifies Ras-driven transcription and confers sensitivity to BRD4-based therapies〔J〕.Nature,2014;514 (7521):247-51.

7Jonkers I,Lis JT.Getting up to speed with transcription elongation by RNA polymerase Ⅱ〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2015;16(3):167-77.

8Liao YF,Wu YB,Long X,etal.High level of BRD4 promotes non-small cell lung cancer progression〔J〕.Oncotarget,2016;7(8):9491-500.

9Yan Y,Yang FQ,Zhang HM,etal.Bromodomain 4 protein is a predictor of survival for urothelial carcinoma of bladder〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2014;7(7):4231-8.

10Shalini S,Dorstyn L,Dawar S,etal.Old,new and emerging functions of caspases〔J〕.Cell Death Differ,2015;22(4):526-39.

11Shi J,Cao J,Zhou BP.Twist-BRD4 complex:potential drug target for basal-like breast cancer〔J〕.Curr Pharm Des,2015;21(10):1256-61.

〔2015-09-17修回〕

(编辑袁左鸣)

慈溪市科技计划项目(CN2015020)

胡坚(1964-)，男，主任医师，教授，主要从事消化道肿瘤研究。

吴丹(1978-)，男，副主任医师，现工作于温州医科大学附属慈溪医院，主要从事消化道肿瘤研究。

R735

A

1005-9202(2016)18-4515-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.055