豚鼠电刺激频率跟随反应初步研究*

丁秀勇　何文欣　张汝祥　陈婧

·实验研究·

豚鼠电刺激频率跟随反应初步研究*

丁秀勇1何文欣2张汝祥3陈婧2

目的探索豚鼠听觉系统对电刺激信号是否存在频率跟随现象。方法经圆窗龛使用纯音和白噪音电信号对豚鼠耳蜗行电刺激，记录其头皮电反应，经Matlab信号叠加和伪迹去除，计算EFFR信号相对幅度、输入输出函数，处死豚鼠和使用电阻代替豚鼠后记录EFFR变化验证EFFR来源。结果纯音电信号可诱发具有明显的周期性的EFFR信号，在797Hz和1597Hz所记录EFFR到的相对幅度（RA）均值明显高于白噪音RA均值（P＜0.05）；797Hz纯音电信号输出幅度随着刺激电刺激幅度增长呈非线性改变，呈现神经反应特有的阈值特性与饱和特性；豚鼠死亡前后EFFR的RA值差异具有高度显著性（P＜0.001），豚鼠EFFR的RA值与使用电阻记录的RA值差异具有显著性（P＜0.05）。结论听力正常豚鼠听觉系统对电刺激信号存在频率跟随现象。

豚鼠；频率跟随；耳蜗；锁相

锁相能力是听觉系统的一项重要功能，对声音音调感知、频率辨别、噪声中的语音识别等听觉功能都密切相关［1］。持续周期性刺激信号是反映出听觉系统神经锁相特性的必要条件［2］，而目前人工耳蜗使用电刺激信号均为短时方波电脉冲信号，因此对人工耳蜗植入者来说，听觉系统能否在电刺激的情况下依然保有与声刺激下类似的锁相能力，目前不得而知。Worden等［3］于1968年首次记录到一系列能够很好地反映声波中的周期性成分的一系列动作电位，这种追随声波中低频成分的反应被称为频率追随反应（frequency-following responses，FFR），后续研究证实头皮记录听觉频率跟随反应（frequencyfollowing response，FFR）可较好的反应听觉系统神经锁相特性［4］，但听觉系统对电刺激是否仍存在频率跟随反应，目前没有可靠证据，本研究拟对豚鼠听觉系统对电刺激信号是否存在频率跟随现象（Electrically-Evoked Frequency-Following Response，EFFR）做一初步探索。

资料与方法

1一般资料

1.1实验动物

清洁级Hartley豚鼠8只，雌雄不限，体重250～300g。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，使用10%水合氯醛（3～4ml/Kg）腹腔注射麻醉，每隔60分钟酌情追加0.3～0.4ml 10%水合氯醛。

1.2实验仪器及设备

记录设备为Neuro-MEP-Micro数字肌电和诱发电位仪（俄罗斯）。使用DS8000数字电刺激器及DLS100电刺激隔离器（World Precision Instruments，WPI，USA）输出电刺激。电刺激器和诱发电位仪之间触发信号线由带屏蔽BNC线缆自行改造转接2.5mm耳机接口而成。刺激电极正极为直径100μm的铂铱合金球状电极，电极球形端直径500μm，除球形端及尾端裸露外，其余电极表面均有Parylene绝缘涂层。刺激电极负极及记录电极使用不锈钢针状电极，两端均裸露约3mm，中间被覆Parylene绝缘涂层。电极由上海派乐化学有限公司加工。

1.3信号生成

使用纯音信号、高斯白噪音电信号圆窗龛电刺激，纯音信号频率为797Hz和1597Hz。刺激信号长度为40ms，使用Matlab软件生成后上传到电刺激器输出。每个刺激信号均采取正负极性交替的方式，包括500次正向刺激和500次负向刺激，总计将获得1000次有效刺激。电刺激的峰峰值为180μA。

记录及降噪

电刺激幅度为10～100μA，均采取正负极性交替的方式，包括500次正向刺激和500次负向刺激，总计将获得1000次有效刺激。Neuro-MEPMicro记录仪记录原始数据导出为XML格式，使用Matlab软件进行读取叠加去伪迹后，使用快速傅立叶变换后计算EFFR信号的幅度谱，目标频率处幅度相对于其周围100Hz范围的平均幅度定义为EFFR相对幅度（RA）。

2实验步骤

切开豚鼠外耳道口上、下极，暴露骨性外耳道口直视鼓膜，以耳显微外科尖针刺破豚鼠鼓膜，暴露圆窗龛，仔细操作勿损伤圆窗膜。显微镜下将刺激电极负极前端弯成钩状固定于圆窗龛骨缘，使球状电极贴附于圆窗膜表面。刺激电极正极置于外耳道前下方皮下，使用干燥无菌棉球置于外耳道固定电极，避免检测中移位。EFFR记录电极位于颅顶正中，参考电极位于同侧乳突皮下，地极位于鼻尖，测试电极阻抗小于2kΩ，极间阻抗小于3kΩ。

实验一分别用高斯白噪音信号、797Hz的纯音和1597Hz的纯音作为电刺激信号，记录不同信号刺激下的诱发电位。

实验二采用797Hz的纯音电信号每间隔10分钟记录一次诱发电位，记录三次之后处死豚鼠，然后继续记录豚鼠死亡后10、20、30分钟后对该电刺激的反应信号。

实验三用1000Ω的电阻替代豚鼠完成实验，分别用797Hz与1597Hz的纯音电刺激信号，刺激电极的正极与记录电极的正极接在电阻一端，刺激电极的负极、记录电极的参考、地极三者一同接到电阻的另外一端。分析该记录信号是否存在FFRs现象。

3统计方法

包括线性回归，双因素重复实验方差分析（Two way repeated measures ANOVA）以及单因素重复实验方差分析（One wayrepeated measure ANOVA）。

结果

1纯音与白噪音刺激下EFFRs的对比

如图1分显示，纯音电信号诱发波形具有明显的周期性，而白噪音电信号诱发波形则没有明显周期性，纯音诱发的信号RA在频谱图797Hz位置具有明显的峰值，而白噪音电信号诱发的信号在频谱图上RA无峰值。8只豚鼠由797Hz纯音电信号诱发的EFFR平均相对幅度RA为23.0（SD=2.3），由1597Hz纯音电信号诱发的信号平均RA为16.7（SD=0.9）。白噪音电信号诱发信号在797Hz处RA为2.2（SD=0.2），在1597Hz处的RA为2.3（SD= 0.2）。双因素（刺激信号类型和频率）重复实验方差分析表明，纯音电信号和白噪音电信号间EFFR平均RA存在显著差异（P＜0.001），797Hz和1597Hz间EFFR平均RA存在显著差异（P＜0.05）。本实验结果表明EFFRs可以反映出听觉脑干的锁相活动，同FFRs的研究结果类似。

图1　797Hz纯音和白噪音电刺激信号EFFRs结果对比

2EFFRs输入输出函数曲线

刺激信号的波形经过快速傅里叶变换得到目标频率处的幅度定义为输出幅度，绘制刺激强度和输出幅度间的输入输出函数曲线。结果如图2所示，输出幅度随着刺激电刺激幅度增长呈非线性改变。采用Greenhouse-Geisser修正的单因素重复实验方差分析显示，电刺激幅度差异具有显著性（P＜ 0.001）。经Bonferroni修正的进一步检验表明：第一，10、20、30μA显著地低于80、90、100，μA（P＜0.05）；第二，输出幅度在10、20、30、40、50、60μA之间的差异无显著性（P＞0.05）；第三，输出幅度在最高的五个刺激幅度60、70、80、90、100？A之间的差异无显著性（P＞0.05）。综上所述，EFFRs信号存在明显的阈值特性与饱和特性。

图2　797Hz纯音电刺激信号EFFR输入输出曲线

3豚鼠死亡前后EFFRs的变化

图3显示8只豚鼠的在死亡前后不同时刻的平均RA。从上可以看出，豚鼠存活时的三次EFFRs测量没有有明显的不同，同样死亡之后的三次EFFRs的测量间也没有明显的不同，豚鼠死亡前的RA值（22～25）明显高于死亡后RA值（6～8）的。双因素重复实验方差分析表明，豚鼠死亡前后RA值差异具有高度显著性（P＜0.001），由此可以看出在活体豚鼠EFFRs的可重复性，EFFRs是神经反应而非电刺激伪迹。

图3　豚鼠死亡前后EFFRs平均相对幅度的变化（n=8）

4电阻替代豚鼠EFFRs记录

伪迹的另外一个产生来源是其它干扰源的耦合。为了排除这种可能，将豚鼠替换为电阻，然后记录信号的变化情况。若信号为伪迹，电阻替代后应该仍可以记录到相应的信号，而信号为神经特有反应，则在用电阻替换掉豚鼠之后，记录到的EFFRs相对幅度明显减弱。8只豚鼠平均RA值在797Hz纯音刺激时为8.6（SD=1.1），在1597Hz纯音刺激时为8.1（SD=1.1）。图4展示了以豚鼠为实验对象和以电阻为实验对象时在相同电刺激信号刺激下的平均RA。双因素重复实验方差分析显示，豚鼠RA值与使用电阻RA值差异具有显著性（P＜0.05），不同刺激频率间差异没有显著性（P＞0.05）。

图4　豚鼠（GP）与电阻间（ER）EFFRs平均相对幅度的差异（n=8）

讨论

哺乳动物听觉信息的存在两种编码方式，空间编码及时间编码。空间编码模式主要依靠内毛细胞调谐特性和其与听神经纤维的一对一传输通道对声波进行分解和传输，即频域分析。时间编码模式依靠听神经纤维在基底膜波动周期的特定相位发放冲动，声波的频率及其他时间特征因而能以锁相发放的形式被传输，即时域分析［5］。人工耳蜗植入是双耳重度感音神经性聋患者重建听觉和语言能力最成功的方法，其原理是通过植入电极取代存在病变的内耳毛细胞功能，直接电流刺激螺旋神经节细胞和听神经而产生听觉。目前对于电刺激听觉的听觉信息编码模式因研究手段有限，虽目前所知不多，但理论上两种编码模式均发挥作用［6，7］，空间编码模式因重度聋患者毛细胞损伤，频域分析只能靠电极位置和残存螺旋神经节细胞间的位置关系实现，受到影响因素较多，发挥作用有限［8］；时域分析功能因不受内毛细胞功能影响，只要听神经功能正常，时间编码模式即可发挥作用，因此理论上对人工耳蜗植入患者，时间编码模式较空间编码模式在听觉信息传递上可能价值更大［9］。但目前尚无可靠证据直接证实该现象。Worden等［3］于1968年首次记录到一系列能够很好地反映声波中的周期性成分的一系列动作电位并将之称为频率追随反应（frequencyfollowing responses，FFRs），后续研究证实头皮记录FFRs可较好的反应听觉系统神经锁相特性［4，10］，是研究听觉系统时间编码模式的良好方法。本研究利用电信号代替声信号刺激豚鼠听觉系统，通过伪迹去除及频谱提取对在其头皮的记录电信号进行分析，了解豚鼠听觉系统是否对电刺激存在频率跟随反应，验证其听觉系统对电刺激的锁相特性，为进一步探索电刺激听觉的的信息编码模式打下基础。

实验结果发现，我们使用纯音电信号刺激豚鼠听觉系统，所诱发出的波形和频谱成分存在明显周期性，而白噪音作为刺激信号所记录波形及频谱则没有明显周期性，表明EFFR可以反映出听觉脑干的锁相活动，同FFR的研究结果类似［2］。和Liu等研究结果认为听神经锁相能力上限是3500Hz，在500Hz-1000Hz间是反应其锁相能力最佳范围［11］，我们结果证实使用797Hz电信号所诱发信号和1597Hz诱发出频率跟随反应信号最明显，3997Hz则基本观察不到频率跟随反应信号（预试验数据），同Liu等结果一致，但需要进一步研究探索电刺激信号的频率跟随反应的作用范围。

为进一步验证我们记录分析的信号为EFFR信号来源于豚鼠的听觉系统生理反应，而不是系统噪声耦合，我们绘制了FFR信号的输入输出曲线特征、处死豚鼠前后EFFR变化和使用电阻代替豚鼠进行EFFR记录，从这三个方面进行了验证。797Hz电刺激信号显示其输入输出曲线呈现明显的的阈值特性与饱和特性，这些特性都是神经反应所拥有而电刺激伪迹所不具备的；处死豚鼠后10分钟EFFR信号相对幅度明显低于活体豚鼠，差异显著，证明EFFR是活体豚鼠的特有现象；在用电阻替换掉豚鼠之后，记录到的EFFR相对幅度明显减弱，证明该信号来源于活体豚鼠，和实验环境噪声无关。我们从三个方面排除了实验环境电磁噪声耦合的可能，证实了我们所记录到的EFFR信号为豚鼠听觉系统的神经反应。为后续进一步研究打下基础。

综上所述，该研究证实正常听力豚鼠听觉系统对电刺激存在频率跟随反应，亦即对电刺激存在锁相特性，间接证明豚鼠电刺激听觉信息传递过程中存在时间编码模式。该研究搭建了可靠的豚鼠听觉EFFR研究平台，对豚鼠听觉系统存在EFFR现象进行了初步的探索，后续研究在刺激模式、信号处理方式方面还有较大优化空间，所观察到的EFFR现象需要进一步在听力损伤豚鼠进一步验证，EFFR中枢机制也需要进一步深入研究。

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5梁之安.听觉信息编码和传输.听觉感受和辨别的神经机制，1999：81-101.

6Friesen LM，Shannon RV，Baskent D，et al.Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels：comparison of acoustic hearing and cochlear implants.J Acoust Soc Am，2001，110：1150-1163.7Gransier R，Deprez H，Hofmann M，et al.Auditory steady-state responses in cochlear implant users：Effect of modulation frequency and stimulation artifacts.Hear Res，2016，335：149-160.

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（收稿：2016-07-25）

Electrically-Evoked Frequency-Following Response（EFFR）of Guinea Pigs

DING Xiuyong，HE Wenxin，ZHANG Ruxiang，CHEN Jing
Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing，100053，China

Objective To explore the Electrically-Evoked Frequency-Following Response whether exist in guinea pig auditory system.Methods Periodic signals and white noise electrical stimuli were used for guinea pigs cochlear electrical stimulation，The EFFR were recorded in the guinea pigs scalp and analyzed，the EFFR also verified by recording of death guinea pigs and electrical resistance.Results EFFR evoked by periodic signals were significantly higher than those evoked by the white noise；the responses decreased significantly after death of the guineapigs；and the responses decreased significantly when the animal was replaced by an electrical resistance.Conclusions Electrically-Evoked Frequency-Following Response can be recorded in the guinea pigs with normal hearing.

guinea pig；Frequency-Following Response；cochlear；phase-locking

·临床研究·

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.04.001

国家自然科学基金面上项目（61473008）；卫生行业科研专项项目（201202001-04）

1首都医科大学宣武医院耳鼻咽喉头颈外科（北京，100053）

2北京大学机器感知与智能教育部重点实验室，言语听觉研究中心

3首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉头颈外科

陈婧，研究员.Email：Chen@cis.pku.edu.cn