犬腹泻性疾病的细菌分离鉴定及药敏试验

2016-10-29盛贤均郭成华贺永建

甘肃畜牧兽医 2016年17期

关键词：耶尔森病犬沙门氏菌

盛贤均，郭成华，贺永建

（1.重庆市荣昌区古昌镇畜牧兽医站，重庆荣昌 402460；

2.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌 402460）

犬腹泻性疾病的细菌分离鉴定及药敏试验

盛贤均1，郭成华1，贺永建2

（1.重庆市荣昌区古昌镇畜牧兽医站，重庆荣昌 402460；

2.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌 402460）

通过对病犬不同类型腹泻病粪便中细菌的分离、鉴定，并分别进行药敏试验，以健康犬作为对照，找出引起犬发生腹泻的细菌性原因，针对不同类型腹泻疾病筛选出最敏感的药物。结果表明犬腹泻性疾病的常见致病菌为大肠杆菌、沙门氏菌、耶尔森菌、变形杆菌，丙氟哌酸、头孢氨噻肟、庆大霉素、链霉素对上述病菌的作用效果较好。

犬；腹泻疾病；细菌；分离；鉴定；药敏试验

随着人民生活水平的提高，人们对宠物的饲养量也日益增加，而在众多的宠物当中，犬无疑是最受欢迎的。此外，因为狗肉营养丰富，味道鲜美，并有强身祛病之功效，自古以来为广大群众所喜爱。近年来随着肉用犬需求量的不断增加，全国范围内的肉犬饲养热持续不降，规模饲养前景看好。但是，一些犬类疾病尤其是犬腹泻病，如宠物犬节日期间因暴饮暴食而引起的消化不良、胃肠炎的病例明显增多，犬瘟热、细小病毒、冠状病毒等病毒性因素所引起的病犬腹泻病，犬大肠杆菌、副伤寒杆菌等所致的细菌性腹泻病等在养犬生产中频繁发生，导致大量病犬死亡，严重威胁着我国养犬业的健康发展。

犬腹泻是指病犬排粪时，出现排粪次数多，粪中水含量大，有时混有血液，粪便数量增多的一种疾病。它是犬发病过程中的一种常见症状，其病因复杂，临床上很多疾病都会导致腹泻。腹泻对机体影响很大，可引起营养不良，维生素缺乏，贫血，降低身体的抵抗力，引起脱水，丧失大量的电解质，如钠、钾、钙及镁等，最终出现电解质紊乱、酸碱中毒，甚至引起死亡［1］。这类病的发生不分季节、地区、年龄，但在养犬生产中犬腹泻多发于幼年犬只。然而，在犬腹泻病的临床治疗中出现了许多治疗无效或效果很差的现象，主要原因可能与细菌的耐药性产生有关。

本研究拟通过对患有不同类型腹泻性疾病的犬粪便中细菌进行分离、鉴定，并分别进行药敏试验，以健康犬作为对照，找出引起病犬发生腹泻的细菌性原因，针对不同类型腹泻疾病筛选出最敏感的药物，以期为犬腹泻性疾病的临床用药，提高临床疗效，避免临床更多耐药菌株的产生，提供科学依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1培养基SS琼脂平板，普通琼脂平板，麦康凯琼脂平板，营养肉汤，三糖铁斜面培养基，半固体琼脂培养基，葡萄糖蛋白胨水溶液，Dumham氏蛋白胨水溶液，各种培养基均为自制，均按文献［2］方法配制。

1.1.2主要药品及试剂葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖微量发酵管，Simmon氏枸橼酸钠微量发酵管，药敏纸片（由杭州微生物试剂有限公司生产），吲哚试剂，甲基红试剂。

1.1.3主要实验器材OLYMBUS显微镜（日本OLYMPUS），电子天平（上海海康电子仪器厂），超净工作台（苏净集团安泰公司制造），可调式移液枪（热电（上海）仪器有限公司），隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），电热鼓风恒温干燥箱（成都电热仪器厂），Electrolux牌冰箱（上海伊莱克斯实业有限公司），天平，灭菌锅，培养皿等。

1.1.4病料来源由荣昌地区兽医门诊提供。

1.1.5实验动物健康50日龄本地犬25只，购于重庆市荣昌区昌元街道附近农户。

1.2实验方法

1.2.1症型分类及病料采集

1.2.1.1根据粪便性状不同分类

出血性腹泻型：病犬排粪次数增加，粪便呈泥状，粪便呈黑色或黑绿色时为小肠出血，粪便表面有血丝或鲜血为大肠出血，有的粪便上有大量伪膜，呈酱油色（番茄汁状）、带有腥臭气味，满足此条件归为出血性腹泻型，此症型共采10个样。

非出血性腹泻型：病犬排粪次数增多，粪便呈稀粥状，呈黄色或黄绿色，常为急性水样下痢，有时粪便中有气泡，粪便中无出血现象，也不见未消化的食物成分，可见于多种病因，满足此条件归为非出血性腹泻型，此症型共采10个样。

消化不良性腹泻型疾病：犬的粪便中会有少量的植物细胞、未消化的饲料颗粒、肌肉纤维，如果这些成分大量存在且排粪次数增多，粪便酸臭，说明犬食量过多、消化不良、肠蠕动过速，食物未被充分消化即被排出，满足此条件归为消化不良性腹泻型，此症型共采10个样。

1.2.1.2病料的采集采取出现腹泻性疾病病犬的粪便（稀粪、血便、含未消化的饲料颗粒的稀粪），先用酒精消毒肛门周围，用无菌棉签在直肠内取适量病料置于无菌试管中，酒精灯灼烧试管口，封闭管口，立即用营养肉汤增菌，放入37℃恒温箱中培养24 h，菌液备用。

1.2.2细菌分离、鉴别培养取出肉汤观察管底有无沉淀，是否浑浊，有无菌环和菌膜。取菌液划线接种于普通琼脂培养基上，37℃恒温培养24 h。取在普通琼脂培养基中生长较好的单个菌落接种到鉴别培养基（SS琼脂培养基，麦康凯培养基）中37℃恒温培养24 h，观察菌落的颜色、形态特征，在鉴别培养基中钩取生长较好的单个菌落接种到普通无菌肉汤中37℃恒温培养24 h，即纯培养物增菌培养，菌液备用。

1.2.3染色镜检挑选上述培养基中的单个菌落，进行革兰氏染色，然后用光学显微镜（10×100）观察菌落形态［3］。

1.2.4生化鉴定

1.2.4.1三糖铁培养基把纯培养物接种到三糖铁斜面培养基，接种时先涂布斜面再穿刺底层，37℃下恒温培养24h，观察培养基变化，观察斜面和底层的颜色变化和产气情况，凡培养基变为黄色者，表示产酸；凡培养基变黄并含气泡者，为产酸产气；凡培养基变为红色者，表示产碱；凡培养基不变色者，表示该菌不发酵此培养基［4］。

1.2.4.2糖发酵把纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖的微量发酵管中，37℃下恒温培养24h，观察产酸产气情况。凡培养基变为黄色者，表示该菌发酵此糖产酸；凡培养基变黄并含气泡者，为发酵此糖产酸产气；凡培养基变为红色者，表示该菌发酵此糖产碱；凡培养基不变色者，表示该菌不发酵此糖［5］。

1.2.4.3甲基红（MR）试验取纯培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养48～72 h，取出后加甲基红试剂3～5滴，凡培养液呈红色者为阳性，以“+”表示；橙色者为可疑，以“±”表示；黄色者为阴性，以“-”表示。

1.2.4.4吲哚（靛基质）试验以接种环将纯培养物接种于Dunham氏蛋白胨水溶液中，置37℃培养24～48 h（可延长4～5 d）；取蛋白胨水培养管先加乙醚少量，塞紧棉塞摇振试管，使乙醚与培养液充分混匀，静置片刻，待乙醚浮于液面上层时，沿管壁加入吲哚试剂2～3滴。凡在乙醚层内出现玫瑰红者为阳性反应，不变色为阴性反应［6］。

1.2.4.5枸橼酸盐利用取纯培养物接种于枸橼酸钠微量发酵管中，置37℃培养48～72 h，观察是否有细菌生长，并观察其颜色变化。凡有细菌生长，培养基变为深蓝色者，为该菌利用枸橼酸盐，否则为阴性反应。

1.2.4.6运动力把纯培养物穿刺接种于半固体培养基，穿刺线应在培养基中央，一直刺到管底，拔出穿刺针时应顺原穿刺线取出，切不可左右滑动，以免影响观察结果。37℃恒温培养24 h，观察半固体琼脂培养管，凡细菌有鞭毛能运动者，则部分或全部半固体琼脂变混浊，凡不运动者细菌仅在穿刺线上生长，穿刺线外围培养基仍然透明。

1.2.5动物复归试验将25只健康50日龄本地犬随机分为5组，每组5只，其中4个组为试验组，1个组为对照组。将所分离到的4种细菌制成含活菌菌液，活菌数为1.5×107。试验组每犬各皮下注射一种菌液2 mL，对照组各皮下注射无菌蒸馏水2 mL。注射菌液后，注意观察犬只的临床症状，每天为其测量体温、呼吸、脉搏并记录，出现腹泻症状后注意观察并记录粪便性状。

1.2.6药敏试验采用药敏试纸扩散法，即将分离菌的纯培养物分别均匀涂抹在普通琼脂培养基上，静置5 min后贴上药敏试纸片。置37℃恒温箱中培养反应24 h，测量药敏试纸片抑菌圈的直径并判定其敏感性［7］。

2　试验结果

2.1细菌鉴别培养及镜检结果

图1　大肠杆菌的麦康凯培养基

图2　沙门氏菌的SS琼脂培养基

图3　大肠杆菌

图4　沙门氏菌

2.2生化试验结果，见表1

表1　各菌种生化鉴别结果

由表1可知，分离出的细菌经三糖铁试验产酸，葡萄糖、乳糖、麦芽糖及甘露糖发酵试验呈阳性，甲基红、吲哚试验及运动力试验呈阳性，说明该菌为大肠杆菌；分离出的细菌经三糖铁试验斜面产碱、底面产酸，葡萄糖、麦芽糖及甘露糖发酵试验呈阳性，甲基红、枸橼酸试验及运动力试验呈阳性，说明该菌为沙门氏菌；分离出的细菌经三糖铁试验产酸，硫化氢试验阳性，麦芽糖及甘露糖发酵试验呈阳性，甲基红及运动力试验呈阳性，说明该菌为变形杆菌；分离出的细菌经三糖铁试验产酸，麦芽糖、蔗糖及甘露糖发酵试验呈阳性，甲基红试验呈阳性，说明该菌为耶尔森菌。

2.3不同症型细菌分离

通过分离鉴别从30个样本中一共分离出四个菌种，即大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、耶尔森菌，分离结果见表2。

表2　不同症型细菌分离结果

由上表可见，大肠杆菌在各种症型中分离出的比例都很高，而在健康对照组中的比例较低，差异显著，说明大肠杆菌为肠道兼性致病菌之一。沙门氏菌在出血性腹泻型和非出血性腹泻型中所占比例较高，与健康对照组比较差异显著，消化不良性腹泻型与健康对照组差异不显著，说明沙门氏菌为原发性致病菌。变形杆菌在各种症型和健康对照组中分离出的比例相当，无显著差异，说明变形杆菌为肠道正常菌之一。耶尔森菌在出血性腹泻型和非出血性腹泻型中所占比例较高，与健康对照组差异显著，消化不良性腹泻型与健康对照组都没有分离出此菌，说明耶尔森菌为原发性致病菌。

2.4动物试验结果观察

试验组犬只36 h内相继出现相应腹泻症状，但是接种大肠杆菌和变形杆菌的试验组中分别有2只和1只犬未出现腹泻症状，其余接种大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌菌液试验组犬只出现不同程度腹泻，犬只排粪次数增多，粪便呈稀粥状，呈黄绿色，粪便中有少量气泡，粪便中无出血现象，也不见未消化的食物成分。接种耶尔森菌菌液试验组犬只均出现腹泻症状，排粪次数增加，粪便呈泥状，粪便呈黑绿色，粪便中有少量伪膜，呈酱油色、带有腥臭气味。对照组的五只犬均未出现腹泻症状。

2.5药敏试验结果观察

表3　各菌种药敏试验结果

判定标准［8］：抑菌圈大于20 mm为极敏，15～20 mm为高敏，10～15 mm为中敏，小于10 mm为耐药

图5　耶尔森菌药敏试验结果

图6　变形杆菌药敏试验结果

从表3可见，药敏试验结果表明丙氟哌酸、头孢氨噻肟、庆大霉素、先锋必素效果明显，对所分离的四种病原菌均有较好的抗菌能力。阿莫西林、卡那霉素可能由于广泛性的使用，病原菌已经对其产生耐药性，故而其抗菌效果较差。

3　分析与讨论

3.1腹泻原因

腹泻是临床中最常见的犬病，也是养犬生产中犬发病后最为常见的症状之一。引起犬腹泻的原因主要有：

3.1.1感染常由细菌感染（如致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等）、病毒感染（如细小病毒、犬瘟热病毒、冠状病毒等）、真菌感染（如白色念珠菌、组织胞浆菌）、寄生虫感染（如弓形体、蛔虫等）造成［8］。当感染时，病原体吸附于肠黏膜表面，不侵入肠黏膜。通过产生毒素引起肠黏膜上皮细胞变性坏死，蛋白质、黏液渗出，同时炎症刺激肠运动加快，造成腹泻；有些病原体吸附侵入肠黏膜，并繁殖和产生毒素，引起肠黏膜的变性坏死，大量渗出。如痢疾杆菌、大肠杆菌等。有些病毒感染侵入小肠上皮细胞，在细胞内繁殖，引起上皮细胞受损脱落，导致吸收功能障碍，产生腹泻，如细小病毒感染、冠状病毒感染等。病原体在侵入肠黏膜细胞时还引起炎性浸润，这些炎性细胞释放炎性介质［9］。引起肠黏膜的变性坏死和渗出，从而导致腹泻。

3.1.2消化机能不全或吸收不良消化机能不全多见于断奶仔犬。由于断奶仔犬胃肠功能不健全，消化酶分泌不足，从吃母乳变成了以饲料为主，加上断奶应激，体内酶的水平下降，影响营养成分的消化和吸收，从而导致腹泻。

3.1.3过食过多的食物在还未来得及消化分解就排出体外，这样的腹泻物中含有大量的消化不全的颗粒饲料和食糜。

3.1.4胃肠道菌群失调性腹泻正常情况下，胃肠道处于有益菌和有害菌相对平衡的状态之中。长期大量使用抗生素，造成机体菌群失调，平衡被打破，容易发生腹泻［10］。

3.2引起腹泻常见菌种分析

本研究通过对3种不同类型的腹泻病犬粪便中的细菌进行分离、染色镜检、培养特性鉴定及生化试验分析，结果分离到的细菌有大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、耶尔森菌。其中沙门氏菌、耶尔森菌为原发性致病菌，大肠杆菌、变形杆菌为犬消化道正常菌群中常在菌。原发性致病菌毒力较强，发生消化道感染时多以原发性致病菌为主；当犬机体某些条件发生改变时，也可引起正常菌群中的条件性致病菌感染消化道［11-13］。试验组分离到的这4种细菌，均为革兰氏阴性菌。据此可知，引起犬消化道感染的病原菌中以革兰氏阴性菌为主。

当然，引起犬腹泻的病原菌还比较多，比较常见的还有金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等，但在本次实验中均未曾分离到。其原因有待进一步探讨。

动物复归试验结果表明：由于大肠杆菌和变形杆菌均为肠道正常菌之一，但此次分离出的大肠杆菌和变形杆菌使试验组中大部分犬只出现腹泻症状，说明此次分离出的大肠杆菌和变形杆菌均有致病性，为肠道兼性致病菌之一；接种沙门氏菌和耶尔森菌菌液的试验组中的犬只均出现腹泻症状，说明沙门氏菌和耶尔森菌为原发性致病菌。

3.3药敏试验分析

药敏试验中，丙氟哌酸、头孢氨噻肟、庆大霉素、先锋必素效果明显，对所分离的五种病原菌均有较好的抗菌能力。阿莫西林、卡那霉素可能由于广泛性的使用，病原菌已经对其产生耐药性，故而其抗菌效果较差。大肠杆菌感染，可能是原发病因，也可能是由其他病因继发大肠杆菌感染［14］。在选用抗生素时不但要考虑其抗菌效果，而且还应考虑其副作用。若其中1种抗生素可以达到治疗效果，应避免同时使用2种或2种以上抗生素。