VEGF/PDGF相关因子在晚期肾透明细胞癌中的表达与舒尼替尼远期疗效的相关性

李耀辉　冯达天　胡骁轶　王　杭　王国民

(复旦大学附属中山医院泌尿外科　上海　200032)



VEGF/PDGF相关因子在晚期肾透明细胞癌中的表达与舒尼替尼远期疗效的相关性

李耀辉冯达天胡骁轶△王杭王国民

(复旦大学附属中山医院泌尿外科上海200032)

目的观察晚期肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)相关因子的表达,并分析其表达量与舒尼替尼远期疗效的相关性。方法选取2010年1月—12月复旦大学附属中山医院收治的转移性晚期肾癌患者20例。所有患者均予患肾根治性切除术,病理证实均为ccRCC。所有患者术后均予舒尼替尼标准给药方案治疗,50 mg每天1次口服,服药4周、停药2周为1个疗程,每6周随访1次,随访至2015年12月底。免疫组化方法检测入组患者病理标本肿瘤组织中VEGF-A、VEGF-C、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGF和PDGFR-α、β的表达水平,计算肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD),并与靶向治疗远期疗效进行相关性分析。结果截至研究终点日期,所有患者均未出现因不能控制的严重不良反应而停药的情况,存活4人,死亡16人,死亡患者均因肿瘤进展导致。Spearman分析显示VEGFR-2高表达与较长的无进展生存时间(progression free survival,PFS)及总生存时间(overall survival,OS)存在显著相关,单因素Cox生存回归分析中VEGFR-2强阳性与肿瘤进展风险降低(OR=0.162,95%CI:0.031～0.839,P=0.030)及死亡风险降低(OR=0.204,95%CI:0.041～1.015,P=0.052)具有较为显著的相关性。结论接受舒尼替尼治疗的晚期ccRCC患者中,VEGFR-2高表达与较长的PFS及OS存在显著相关,VEGFR-2强阳性与肿瘤进展风险降低及死亡风险降低显著相关,提示VEGFR-2有可能成为晚期肾癌靶向治疗的远期疗效预测因子。

肾癌;转移;舒尼替尼;血管内皮生长因子;血小板衍化生长因子

肾细胞癌已经成为泌尿系统最常见的肿瘤之一,严重危害着人类生命健康。近10年来,靶向治疗药物的出现使得晚期转移性肾癌的治疗出现了令人鼓舞的改变[1]。它们以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)为主要靶标,代表药物有舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)等,其对晚期转移性肾癌的疗效明显优于干扰素[2-3]。而临床上更多的现实情况是,患者使用靶向治疗药物后在短期内肿瘤得到一定控制,但由于肿瘤继发性耐药以及肾毒性的出现,其远期生存仍然不甚理想[4]。因此,寻找晚期肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)对分子靶向药物治疗远期疗效的预测因子,有重要的临床意义。VEGF及PDGF可激活相应受体从而激活下游信号分子产生一系列生物效应,诱导肿瘤新生血管生成,直接或间接地促进肿瘤细胞的增殖和转移。舒尼替尼即以VEGF及PDGF为靶标,故VEGF及PDGF可能是潜在的靶向药物治疗远期疗效的预测因子。

本研究回顾性分析2010年1月—12月复旦大学附属中山医院收治的晚期肾癌患者20例,检测其病理标本中肿瘤组织内VEGF和PDGF相关因子的表达水平,并与长期随访结果进行相关分析,旨在为晚期ccRCC的分子靶向药物治疗寻找合适的远期疗效预测因子。

资 料 和 方 法

研究对象和给药方案在复旦大学附属中山医院肾癌数据库中选取2010年1月—12月收治的晚期肾癌患者(Ⅳ期)20例(2010AJCC分期标准)。纳入标准:在本院手术并可获取病理标本;病理证实为ccRCC;至少有1处不可切除且可测量的转移病灶;在本院进行舒尼替尼靶向治疗并接受长期随访;均未接受其他抗肿瘤全身性系统治疗。入组结果:男性14例,女性6例,中位年龄55岁;所有患者均接受患肾根治性切除手术,术后病理均证实为ccRCC;MSKCC(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)评分均为低中危;所有患者术后予舒尼替尼治疗,每6周(1个用药周期)随访1次至2015年12月底随访期满。其中每个周期进行1次安全性评价,每2个周期进行1次有效性评价。舒尼替尼给药方案为标准的4/2方案[5],50 mg每日1次口服,服药4周后停药2周为1个周期。如出现不良反应酌情减量(最高可减至25 mg)或停药,服药起始时间一般为术后2～4周,按以上方案给药至肿瘤进展或出现难以控制的严重不良反应。随访观察的时间为2011年1月至2015年12月,随访终点为患者死亡或失访。

疗效和评价标准 有效性评价采用实体肿瘤疗效评价标准(response evaluation criteria in solid tumors 1.1,RECIST 1.1)评估疗效[6]。安全性评价则主要观察患者的不良反应,不良反应分级按照国际不良反应标准(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events,version 4.0,NCI-CTC 4.0)进行分级[7]。随访终点的主要观察指标为无进展生存期(progression free survival,PFS)及总生存期(overall survival,OS)。

免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)手术切除的肿瘤组织标本按常规方法进行免疫组化染色。相关指标包括VEGF、VEGFC、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGF、PDGFR-α、PDGFR-β及肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)。染色完成后,用奥林巴斯DP72相机在相同曝光条件下拍照,在高倍视野下,每份标本随机取5个视野拍摄并保存照片,像素为4 140×3 096。所获得的图片用Image Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)软件进行分析,设置滤过尺寸50像素,根据图片设置适当的HSI参数,宏操作自动分析图片,获得累积光密度值(IOD),为方便计算,定义相对强度=50×IOD/4140/3096。MVD计算:每张照片人工计数血管数目。

结　　　果

肾细胞癌组织的免疫组化检测结果红色为细胞质,蓝色为细胞核,VEGF及VEGFR显示为棕色颗粒着色,在细胞膜及细胞质中均有定位(图1)。PDGF及PDGFR呈棕色显色,亦见于细胞膜及细胞质,CD34阳性定位于血管内皮细胞的细胞质,呈棕色(图2)。VEGF相关指标中，以VEGFR-2的强度最高(2.81±1.36);PDGF相关指标中，则PDGFR-2的强度最高(3.33±1.56),平均微血管密度为23.86±11.39(表1)。

肾细胞癌标本各免疫组化指标表达与PFS和OS相关性分析截止随访期满之日,本组患者无一例失访,且均未出现因不能控制的不良反应而停药的情况,但已经有16名患者死亡,故本研究中可以对其PFS及OS进行评价。中位随访时间为31(7～66)个月。

在PFS、OS与各免疫组化指标的相关分析中,VEGFR-2显示与PFS(r=0.631,P=0.003)及OS(r=0.477,P=0.033)显著相关(图3),而血管MVD与PFS(r=0.405,P=0.095)、OS(r=0.421,P=0.082)之间虽具有一定的相关趋势,但未达到统计学显著性。

根据文献提供的研究方法,把各免疫组化相对强度,以阴性(25%)、弱阳性(50%)、强阳性(25%)的比例进行划分[8],据此进行Kaplan-Meier生存回归及Cox生存回归分析。在Kaplan-Meier生存回归中,PFS(P=0.042)及OS(P=0.021)在VEGFR-2各组之间差异具有统计学意义 (图4)。OS在MVD各组之间差异具有统计学意义 (P=0.049),但PFS在MVD各组之间的差异无统计学意义(P=0.061,图5)。

表1　ccRCC组织免疫组化结果(相对强度)

在Cox生存回归分析中,根据之前的免疫组化强度分组,以各指标的阴性样本为参考值,先对各免疫组化指标进行单变量Cox回归分析,其中P<0.1者进入多变量回归分析,结果以OR值及其95%CI表示。在单变量Cox回归分析中,VEGFR-2强阳性表现出与肿瘤进展风险降低具有显著的相关性(OR=0.162,95%CI:0.031～0.839,P=0.030),VEGFR-2弱阳性与肿瘤进展风险降低虽未达到统计学意义,但具有明显的相关趋势(OR=0.330,95%CI:0.102～1.067,P=0.064)。而MVD弱阳性与肿瘤进展风险降低也具有相关趋势,但未达到显著的统计学差异(OR=0.379,95%CI:0.124～1.159,P=0.089)。多变量Cox回归分析则显示相较于VEGFR-2强阳性(OR=0.150, 95%CI:0.017～1.327,P=0.088)及MVD(OR=0.378,95%CI:0.125～1.145,P=0.085),VEGFR-2弱阳性与肿瘤进展风险降低相关性更加显著(OR=0.298, 95%CI:0.088～1.010,P=0.052)。在针对OS的单因素Cox回归分析中,VEGFR-2强阳性(OR=0.204,95%CI:0.041～1.015,P=0.052),VEGFR-2弱阳性(OR=0.348, 95%CI:0.102～1.185,P=0.091)及MVD(OR=0.360,95%CI:0.118～1.096,P=0.072)表现出与死亡风险降低具有相关趋势,但未达到统计学显著性(图6)。多变量Cox回归分析则显示VEGFR-2强阳性(OR=0.215,95%CI:0.026～1.806,P=0.157)、VEGFR-2弱阳性(OR=0.355, 95%CI:0.101～1.252,P=0.107)、MVD(OR=0.385, 95%CI:0.127～1.170,P=0.092)虽与死亡风险降低具有相关趋势,但均未达到统计学显著性。

随着科技的进步,小分子靶向药物治疗包括肾癌在内的许多恶性肿瘤已经广泛应用于临床并取得了良好的效果[9]。虽然国内外均有研究表明,舒尼替尼对于晚期肾癌的控制具有显著效果[2-3,10],但在临床实践过程中,也会发生原发性和继发性耐药[11]。对于晚期肾癌,PDGF及VEGF均与VHL基因密切相关,这两种生长因子通过与其受体的结合,启动下游信号通路导致血管内皮细胞增殖及血管生长,并促进肿瘤的增长及浸润[12]。根据既往的研究及药理学原理,肿瘤细胞内VEGF及PDGF及其受体等相关分子的表达可能与靶向治疗的疗效有一定相关性[13]。

在舒尼替尼的扩大临床试验中,其意向分析人群的中位OS达到了28.1个月[ 14]。因此,对舒尼替尼远期疗效的观察,尤其是对长期生存的观察,需要足够长的随访时间。本研究中的随访观察时间长达5年,完全符合观察远期疗效的要求。

在免疫组化结果与随访结果的相关性分析中,我们发现,在晚期肾透明细胞癌患者中,肿瘤内VEGFR-2与PFS和OS存在显著相关,而血管MVD与PFS和OS也存在一定的相关性,但未达到统计学意义。总的来说,VEGFR及PDGFR表达水平越高,肿瘤血管更加丰富,肿瘤生长也更快、侵袭性更强,舒尼替尼等小分子靶向药物治疗的效果也将越好,即PFS及OS越长,这也验证了我们之前的假设。随后,我们根据测量结果,按照一定方法把患者根据各指标表达强弱,分为阴性、弱阳性及强阳性三组,比较其PFS与OS的差异,发现VEGFR-2在PFS比较上具有显著的统计学差异。

在单变量Cox回归分析中,VEGFR-2强阳性显示与肿瘤进展风险降低及死亡风险降低的显著相关,即VEGFR-2表达强度越高,肿瘤进展及死亡的风险越低。但是在之后的多变量Cox回归分析中,其相关的显著性出现了较明显的下降,原因可能是在多变量回归分析中,由于血管MVD这一变量的引入,导致其与VEGFR-2产生相互影响进而降低统计学的显著性。

在本研究中,我们通过长期的临床随访,初步探讨了血管相关因子在肿瘤标本中的表达与靶向治疗远期疗效之间的关系。结果提示:VEGFR-2及血管MVD等VHL基因相关指标的高表达与较长的PFS及OS存在较为显著的相关性,特别是VEGFR-2在生存回归中显示出了与PFS与OS的显著相关性。PDGF相关因子表达与舒尼替尼远期疗效无显著相关性,这和先前的某些研究结果类似,提示肿瘤靶向治疗的相关因素非常复杂。因此,临床选择小分子靶向药物治疗患者时,可以根据其肿瘤组织中相关基因表达的情况进行筛选,当然这仅是决策依据之一。这方面已经有越来越多的分子标记被提出并验证[15-19]。

VEGFR-2等VHL基因相关指标的高表达与较长的PFS及OS存在相关性,其中尤以VEGFR2的意义更大。在小分子靶向药物治疗肾细胞癌的临床实践中,这有可能成为其远期疗效的预测因子,但需要更大样本的前瞻性研究验证。

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E-mail:hu.xiaoyi@zs-hospital.sh.cn

The relationship between VEGF/PDGF expression and prospective efficacy of sunitinib in metastatic renal cell carcinoma

LI Yao-hui, FENG Da-tian, HU Xiao-yi△, WANG Hang, WANG Guo-min

(DepartmentofUrology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

ObjectiveTo explore the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and platelet-derived growth factor(PDGF),and their relationship with prospective efficacy of tyrosine kinase inhibitor sunitinib in metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC).MethodsTwenty patients with histologically proven metastatic ccRCC were selected between Jan., 2010 and Dec., 2010.All patients underwent radical nephrectomy and then were followed up to Dec.,2015.All patients received a standard regimen of sunitinib (a dose of 50 mg given orally once daily for 4 weeks on and 2 weeks off,6 weeks per cycle).Tissue microarrays from primary tumor specimens of all patients were

kidney neoplasm;metastasis;sunitinib;vascular endothelial growth factor;platelet-derived growth factor

R737.11

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.04.006

2016-01-10;编辑:王蔚)

复旦大学附属中山医院青年科研启动基金(ZH2010-385)

immunohistochemically stained for selected markers,including PDGF,PDGFR-α,β,VEGF-A,VEGF-C and VEGFR-2,3.And the results of immunohistochemistry (IHC) and microvessel density(MVD) were compared with patients′ survival.ResultsTo the date of statistical analysis,16 patients died of tumour progression.High expression of VEGFR-2 was significantly correlated with the longer progression free survival (PFS) and overall survival (OS) in Spearman correlation analysis.Cox regression analysis revealed that a strong positive of VEGFR-2 was significantly associated with both lower risk of tumor progressing(OR=0.162,95%CI:0.031-0.839,P=0.030) and lower mortality risk(OR=0.204,95%CI:0.041-1.015,P=0.052).ConclusionsFor ccRCC patients who treated with sunitinib,high expression of VEGFR-2 was significantly correlated with the longer PFS and OS,while a strong positive of VEGFR-2 was significantly associated with both lower risk of tumor progressing and lower mortality risk.VEGFR-2 could be a predictive factor for making a clinical decision in RCC targeted therapy.

*This work was supported by Youth Scientific Research Project of Zhongshan Hospital,Fudan University(ZH2010-385).