人抗凝血酶Ⅲ效价检测方法验证及应用

刘晓薇谢一舟卢奎林陈品全黄洁朱席德慧

（1.四川大学生命科学学院 四川成都 610064；2.成都蓉生药业有限责任公司 四川成都 610065）

人抗凝血酶Ⅲ效价检测方法验证及应用

刘晓薇1，2谢一舟2卢奎林2陈品全2黄洁2朱2席德慧1*

（1.四川大学生命科学学院 四川成都 610064；2.成都蓉生药业有限责任公司 四川成都 610065）

本文参照药品质量标准分析方法验证指导原则， 在验证中对专属性、线性、准确度、中间精密度、重复性和范围6个参数进行确认，以考察成都蓉生药业有限公司新建立的人抗凝血酶Ⅲ（Antithrombin III， ATIII）效价检测方法是否符合要求。通过验证，人抗凝血酶Ⅲ效价检测方法在专属性、线性、准确度、中间精密度、重复性和范围6个方面均符合要求，因此此方法可用于成都蓉生药业有限公司人抗凝血酶Ⅲ效价检测。通过验证确认人抗凝血酶Ⅲ效价检测方法的检测范围是0.0057-0.0130IU/ml。

人抗凝血酶Ⅲ 效价

人抗凝血酶III属于血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine Protase Inhibitors， Serpins）。是血浆生理性抑制物中最重要的抗凝物，其抗凝作用大约占体内总抗凝作用的70%。在血浆中，ATIII通过与FXa、FIIa等活化凝血因子（酶形式）形成共价复合物，导致其酶活性失活，起到抑制凝血因子酶活性的作用，防止血栓的形成，从而起到调节血凝平衡的作用。ATIII自上世纪80年代应用于临床以来已成为临床急救用药，可用于ATIII遗传性缺陷患者在怀孕、分娩及大手术前以预防血栓发生，也可用于重症感染患者、弥撒性血管内凝血患者等获得性ATIII缺乏患者的紧急治疗。

根据药品质量标准分析方法验证指导原则，在对药品分析方法展开的验证内容一般包括：专属性、准确度、精密度（涵盖三类：重复性、中间精密度以及重现性）、耐用性、线性、检测限、定量线以及范围［1］。在验证实施时可依据实际情况对验证的内容进行设定［2］。

本文介绍了对成都蓉生药业有限公司新建立的人抗凝血酶Ⅲ效价检测方法的验证及其应用。所验证的方法是：将供试品中加入过量凝血酶，使抗凝血酶与凝血酶形成1：1复合物，剩余的凝血酶作用于发色底物S-2238，释出显色基团对硝基苯胺（PNA）。显色的深浅与剩余凝血酶呈正相关，而与人抗凝血酶Ⅲ呈负相关，根据样品吸光度值，从标准曲线中计算出人抗凝血酶Ⅲ的活性。

1 材料与设备

蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ复溶血浆、S-2238试剂、肝素钠试剂、人抗凝血酶试剂、牛血清蛋白试剂、纯化水、人抗凝血酶成品、甘氨酸、枸橼酸。50-200ul单通道移液器（芬兰雷柏）、100-1000ul单通道移液器（芬兰雷柏）、万分之一分析天平（梅特勒-托利多）、恒温水浴箱（精宏）、Power Wave TM XS2酶标仪（Bio-Tek）。

2 实验方法

人抗凝血酶Ⅲ效价检测验证方案。

2.1.1 专属性确认

测定次数 　预估值（I U / m l） 　检测值（I U / m l） 　回收率（%） 　可接受标准1 　1 . 1 0 　1 . 0 3 　9 3 . 9 2 　1 . 1 0 　1 . 0 3 　9 3 . 9 3 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 4 4 　1 . 1 0 　1 . 0 4 　9 4 . 6 5 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 6 6 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 6 7 　1 . 1 0 　1 . 0 7 　9 7 . 2回收率为8 5 % -1 1 5 % 8 　1 . 1 0 　1 . 0 3 　9 3 . 5 9 　1 . 1 0 　1 . 0 5 　9 5 . 6 1 0 　1 . 1 0 　1 . 0 1 　9 1 . 6 1 1 　1 . 1 0 　0 . 9 9 　8 9 . 8 1 2 　1 . 1 0 　0 . 9 9 　8 9 . 8

配制浓度（I U / m l） 　0 . 0 0 5 7（I U / m l） 　0 . 0 0 6 7（I U / m l） 　0 . 0 0 8 0（I U / m l） 　0 . 0 1 0 0（I U / m l） 　0 . 0 1 3 0（I U / m l）标准溶液相关系数r2　可接受标准试验次数 　O D值1 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 3 　0 . 0 0 7 8 　0 . 0 0 9 9 　0 . 0 1 2 3 　0 . 9 9 7 2 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 2 　0 . 0 0 8 1 　0 . 0 0 9 5 　0 . 0 1 1 9 　0 . 9 8 7 r2≥0 . 9 8 0 0 3 　0 . 0 0 5 3 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 0 8 0 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 3 3 　0 . 9 9 7配制浓度（I U / m l） 　0 . 0 0 5 7（I U / m l） 　0 . 0 0 6 7（I U / m l） 　0 . 0 0 8 0（I U / m l） 　0 . 0 1 0 0（I U / m l） 　0 . 0 1 3 0（I U / m l）样品实测相关系数r2　可接受标准试验次数 　O D值1 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 3 　0 . 0 0 7 8 　0 . 0 0 9 9 　0 . 0 1 2 3 　0 . 9 9 0 2 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 0 7 9 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 2 8 　0 . 9 9 0 r2≥0 . 9 8 0 0 3 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 0 　0 . 0 0 7 2 　0 . 0 0 9 2 　0 . 0 1 1 0 　0 . 9 8 7试验次数 　0 . 0 0 5 7（I U / m l） 　0 . 0 0 6 7（I U / m l） 　0 . 0 0 8 0（I U / m l） 　0 . 0 1 0 0（I U / m l） 　0 . 0 1 3 0（I U / m l） 　　相关系数r 　　可接受标准样品实测效价相关系数r 1 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 3 　0 . 0 0 7 8 　0 . 0 0 9 9 　0 . 0 1 2 3 　0 . 9 9 0 2 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 0 7 9 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 2 8 　0 . 9 9 5 r≥0 . 9 8 0 0 3 　0 . 0 0 5 0 　0 . 0 0 6 0 　0 . 0 0 7 2 　0 . 0 0 9 2 　0 . 0 1 1 8 　0 . 9 8 9测定次数 　0 . 0 0 5 5 I U / m l 　0 . 0 0 6 7 I U / m l 　0 . 0 1 7 0 I U / m l 　　可接受标准样品实测回收率（%）1 　1 0 5 . 3 　9 6 . 4 　1 0 4 . 3 2 　1 1 1 . 8 　1 0 5 . 7 　9 9 . 4回收率为8 5 % -1 1 5 % 3 　1 1 0 . 8 　1 0 3 . 7 　1 0 1 . 8

样品浓度（I U / m l） 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 1 7 0检测结果（I U / m l） 　0 . 0 0 5 8 　0 . 0 0 6 1 　0 . 0 0 6 1 　0 . 0 0 6 4 　0 . 0 0 7 1 　0 . 0 0 6 9 　0 . 0 1 7 7 　0 . 0 1 6 9 　0 . 0 1 7 3平均值 　0 . 0 0 6 0 　0 . 0 0 6 8 　0 . 0 1 7 0 S D 　0 . 0 0 0 1 9 　0 . 0 0 0 3 3 　0 . 0 0 0 4 1 R S D（%） 　3 . 2 　4 . 8 　2 . 4试验日期 　2 0 1 4 -0 9 -1 4 　2 0 1 4 -0 9 -1 5 　2 0 1 4 -0 9 -1 6 　2 0 1 4 -0 9 -1 7 　2 0 1 4 -0 9 -1 8 　2 0 1 4 -0 9 -1 9试验结果（I U / m l） 　　检测员B 　5 7 . 8 　5 5 . 0 　5 7 . 8 　5 7 . 8 　5 7 . 7 　5 6 . 3检测员A 　5 6 . 7 　5 6 . 3 　5 9 . 6 　5 7 . 0 　5 7 . 5 　5 6 . 4 1 2次数据R S D 　2 . 0 %方差分析（F检验） 　　日期因素 　F值 　0 . 1 2 2 7 0 3 　P值 　0 . 7 4人员因素 　F值 　3 . 1 7 3 8 4 6 　P值 　0 . 1 2可接受标准 　　人员和日期两因素在α = 0 . 0 5水平上均对方法精密度无显著性影响（P＞0 . 0 5）R S D≤1 0 . 0 %线性确认结果样品实测效价（I U / m l） 　0 . 0 0 5 7 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 0 8 0 　0 . 0 1 0 0 　0 . 0 1 3 0线性相关系数r2　0 . 9 9 1准确度确认结果样品实测效价（I U / m l） 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 1 7 0准确度/回收率（%） 　1 0 4 . 2重复性确认结果样品实测效价（I U / m l） 　0 . 0 0 5 5 　0 . 0 0 6 7 　0 . 0 1 7 0 R S D值（%） 　3 . 5

将人抗凝血酶Ⅲ成品效价配制为1.1IU/ml，与理论效价值为1.1IU/ml的蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ复溶血浆配制成1：1溶液，得到混合样品。检测混合样品的人抗凝血酶Ⅲ效价并计算回收率。确认用酶标仪测定人抗凝血酶Ⅲ效价是否受到配制原液的基质干扰。混合样品的人抗凝血酶Ⅲ效价回收率范围应在85%～115%。

2.1.2 线性确认

用纯化水将蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ复溶血浆配制成效价为0. 005、0.0057、0.0067、0.008、0.01IU/ml的溶液；另用纯化水将人抗凝血酶Ⅲ样品配制成各因子效价为0.005、0.0057、0.0067、0.008、0. 01IU/ml的溶液。对上述样品进行3次检测。确认蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ复溶血浆和人抗凝血酶Ⅲ样品配制浓度与检测OD值是否成线性关系。蓉生自制人抗凝血酶Ⅲ复溶血浆和人抗凝血酶Ⅲ样品线性回归系数r2≥0.9800。

2.1.3 准确性确认

将人抗凝血酶Ⅲ样品配制成效价为0.005、0.0067、0.01IU/ml的溶液，对样品进行3次检测。计算回收率。确认人抗凝血酶Ⅲ样品的准确度是否符合要求。回收率应为85%～1115%。

2.1.4 重复性确认

将人抗凝血酶Ⅲ样品配制成效价为0.005、0.0067、0.01IU/ml的溶液，对样品进行3次检测。计算每个浓度三个结果的RSD。确认由同一分析人员在同样的操作条件下，在较短时间间隔内所得测定结果之间的精密度是否达到可接受标准要求。可接受标准为RSD≤15.0%。

2.1.5 中间精密度确认

取人抗凝血酶Ⅲ样品，由不同的人员对人抗凝血酶Ⅲ的效价进行检测。共检测6次，每天一次。取2人总共12次测定结果计算其相对标准偏差（RSD）。对测定结果进行方差分析，对人员和日期两因素进行F检验。确认在不同分析人员和不同日期两种因素影响下测定同一样品时，两分析人员在不同日期测定结果的精密度是否达到可接受标准。两位分析人员的测定结果相互符合的程度是否达到可接受标准要求，不同日期的检测结果相互符合程度是否达到可接受标准。 可接受标准为（1）RSD≤15.0%；（2）经F检验后，人员和日期两因素在α=0.05水平上均对方法精密度无显著性影响（P＞0.05）。

2.1.6 范围确认

根据以上线性，重复性和准确性的试验结果，就可推论出该检测方法能够测定的人抗凝血酶Ⅲ效价的区间。满足线性r≥0.98，回收率应为85%～115%，重复性RSD≤15.0%的人抗凝血酶Ⅲ效价的最高值和最低值之间的区间即为该检测方法的范围。

3 实验结果

3.1.1专属性确认

3.1.2 线性确认

2.1.3 准确性确认

2.1.4 重复性确认

2.1.5 中间精密度确认

人员和日期两因素在α=0.05水平上均对方法精密度无显著性影响（P＞0.05）

2.1.6 范围确认

验证结果：该方法的检测范围为：0.0057-0.0130IU/ml。

4 讨论

本文的总体思路是对成都蓉生药业有限公司新建立的人抗凝血酶Ⅲ效价检测方法展开验证，确定是否适用于本实验室新产品活性检测。由于在人抗凝血酶Ⅲ成品中添加甘氨酸作为稳定剂，在专属性检测中考察了它是否会干扰该方法的测定。通过验证结果得知该方法的检测范围是0.0057-0.0130IU/ml，可给予其他实验室的方法验证和设计提供一个参考，同时获得了产品验证过程中涉及的一系列参数，从而保证结果的稳定和有效，对人抗凝血酶Ⅲ成品的工艺研究提供可靠的数据支撑，让更多人抗凝血酶Ⅲ缺乏病患能够得到一定治疗。

验证开始需要对使用的计量器具的校验有效日期进行验证，这直接关系到整个实验结构是否具备有效性。今后还需要进一步探讨各种人抗凝血酶Ⅲ效价检测方法的优缺点，建立新的实验方案和设计，选择于本实验室条件下效果最优的。参考文献

［1］药品生产验证指南国家食品药品监督管理局药品安全监管司/药品认证管理中心.2003［S］.北京： 化学工业出版社， 2003.

［2］周志军，李策生，李陶敬等.检测人凝血因子Ⅷ 蛋白质含量的BCA法的优化及验证［J］.中国生物制品学，2013，26（10） .

［3］万智.两种方法用于抗凝血酶III检测的临床价值比较.国际检验医学杂志2014年06月第35卷第11期.

［4］李灵娟.抗凝血酶III测定的临床意义.实用医技杂志2013年10月第20卷第10期.

R917

A

1674-2060（2016）02-0169-02

刘晓薇（1987—），女，汉族，四川成都人，。现从事于血液制品行业，就职于成都蓉生药业有限责任公司，具有7年的生产工作经验，同时为四川大学生命科学学院2012级在职研究生。