C反应蛋白对大鼠骨髓内皮祖细胞参与血管形成的影响

朱智 刘勇 何延政

（泸州医学院附属医院血管甲状腺外科 四川泸州 646000）

C反应蛋白对大鼠骨髓内皮祖细胞参与血管形成的影响

朱智 刘勇 何延政

（泸州医学院附属医院血管甲状腺外科 四川泸州 646000）

目的：析CRP对大鼠骨髓内皮祖细胞参与血管形成的影响，同时剖析其在动脉粥样硬化病中的作用机制。方法：密度梯度离心法制作好的大鼠骨髓内皮祖细胞，标记、凝聚双染后在共聚焦显微镜下观察分析。将细胞与不同浓度C反应蛋白一起培养，建立体外血管形成模型，观察C反应蛋白对内皮祖细胞活性和形成能力的影响，并检测其他相关指标。结果：四组比较，当C反应蛋白浓度升高时，10mg/L组的OD490增值数、管腔数以及渗入细胞数，明显低于其他三组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：CRP在一定程度上可起到减弱内祖皮细胞活性与形成能力的双重作用，并导致动脉粥样硬化类疾病在短时间内实现进一步发展。

C反应蛋白 大鼠骨髓内皮祖细胞 影响 密度梯度离心法

1 一般资料与方法

1.1 一般材料

实验对象 SD大鼠，其体质量在100至120克的范围之内，平均（109.4±3.7）克，提供机构为：泸州医学院医学动物实验室。

实验试剂 （1）Cascade Biologics有限责任公司提供：大鼠心脏微血管内皮细胞；M200培养液；LSGS。（2）Molecular Probes 有限公司提供：乙酰化低密度脂蛋白。（3）天津灏洋生物制品集团提供：大鼠淋巴细胞分离液。（4）Sigma公司提供：噻唑蓝；CRP；DAPI染色液；DMSO；胰蛋白酶。（5）天津生物化学制品厂提供：胎牛血清。（6）Santa Cruz集团提供：Bax；VEGF兔抗大鼠多克隆抗体；Bcal-2；整合素β 2。（7）Gibco集团提供：DMEM培养基。

1.2 方法

1.2.1 分离并培养内皮组细胞［1］

借助乙醚，对实验大鼠进行麻醉，然后于无菌环境下，取其胫骨以及股骨。把胫骨以及股骨两端规范化的剪开，以将髓腔充分暴露出来。选取无菌注射器，同时抽取PBS药液，20ku/L，对骨髓腔实施冲洗操作。取骨髓细胞悬液，并实施过滤。此后，以1000转/分的速率，对过滤液进行离心。滤去上清液，同时应用PBS，制作全新的骨髓细胞悬液。按照2：1的原则，将悬液滴入大鼠淋巴细胞分离液中，然后再以2000转/分的速率，离心25分钟。于管壁周缘，吸取适量白膜层细胞，并将其置入离心管内；向管中加入一定量的PBS，以充分洗涤细胞。取M200培养液，并将其制作成实验所需的细胞悬液。按照106/ cm2的规格，向培养瓶中实施接种操作。接种完毕后，将培养瓶放于孵育箱中（温度：37摄氏度；CO2浓度：5%）。1日后，取出，并将其转移至另一培养瓶中。连续培养3日，以除去成熟的血小板以及内皮细胞。此后，换液，并继续培养3日。将经过7日培养的细胞当作最终的鉴定目标。

1.2.2 鉴定［2］

取乙酰化低密度脂蛋白，2.4毫克/升，并于37摄氏度的恒温条件下，对鉴定细胞进行为期2小时的孵育。借助多聚甲醛，对细胞进行固定，维持10分钟。此后，利用PBS，对细胞实施洗涤操作。洗涤完成后，加入一定量的植物凝集素，并将其置于室温下，进行为期1小时的孵育。待双重荧光染色成功之后，利用显微镜，对其进行全面的观察。

1.3 分组

实验开始前，取适量DMEM培养液，对细胞进行连续2小时的培养。本次研究的分组标准为：（1）CRP组。按照浓度的不同，将其分为3组：1mg/L组；5mg/L组；10mg/L组。（2）对照组。不含DMEM培养液。

1.4 体外模型构建［3］

借助DAPI染色液，对经过CRP处理的EPC进行标记；取适量胰蛋白酶，对大鼠骨髓CMEC以及EPC进行消化处理，并按照两者4：1的原则，制作混合细胞悬液。将已经制作好的悬液接种于24孔板内。利用显微镜对培养细胞进行观察。统计C M E C管腔中含有的EPC数量。

1.5 活性检测［4］

按照上述步骤，消化并采集贴壁细胞。取DMEM培养液，并将其制作成细胞悬液，然后再将悬液进行接种。贴壁完成后，更换培养液（未加入胎牛血清），并向其中加入适量不同浓度的CRP。维持1日。CRP组，均设置3个平行孔。

实施检测前，加入MTT，5克/升，并置于37摄氏度环境下孵育4小时。吸除培养液，同时加入DMSO，150微升。充分混合后，利用免疫检测仪，对其实施OD490检测。

1.6 内祖皮细胞形成能力检测

采集贴壁细胞，将其接种于24孔板内，并加入适量不同浓度的CRP。培养1日后，借助显微镜，对其实施管腔计数。

1.7 统计学分析

本次调查的所有数据均以SPSS 20.0 软件，对其进行分析与研究，比较以t作为检验标准；计数资料的比较经x2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 四组检测结果的对比分析表 ［n，（%）］

2 结果

2.1 鉴定结果分析

连续培养7日后，于显微镜下能看到多个贴壁细胞集落，其中心细胞呈圆形，且沿“中心-四周”路径，细胞主要以梭形状存在，这一情况和胚胎时期所形成的血岛具有一定的相似性。经过双重荧光染色后，在显微镜下能观测到：细胞不仅可以对ac-LDL进行吞噬，同时也能与UEA-l相结合。此时，细胞可被判定为：正处于分化过程中的EP C。

2.2 活性检测结果分析

CRP组与对照组相比：10mg/L组内皮祖细胞的活性最弱，对照组活性最强，差异显著，具有统计学意义（P＜0.05）。提示：CRP浓度越高，其减弱大鼠骨髓EPC活性的能力越强。检测结果，详见表1。

2.3 形成能力检测结果分析

四组管腔形成数比较，10mg/L组最少，对照组最多，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示：CRP浓度越高，其阻滞大鼠骨髓EPC形成管腔数的能力越强。

3 讨论

现阶段，“As炎症学说［5］”在临床医学界已经确立，而C反应蛋白也成为了心血管类疾病预后效果的判定以及预测因子，其除了具备较强的敏感性与独立性之外，还能通过对相关细胞（主要为：平滑肌细胞；内皮细胞）进行刺激的方式，来达到促使病变进一步发展的目的。有资料，显示：当人体组织中的C反应蛋白浓度在1至3毫克/升的范围之内时，可将其判定为：中度危险因素；当C反应蛋白浓度超过3毫克/升时，可将其判定为：重度危险因素。

近年来，随着医学专家对CRP的进一步的研究，我们对其有了更多的认识，具体表现为：CRP［6］除了具备加快内皮细胞凋亡速度的作用之外，还同时兼具如下几个特点：1）利于核因子在人体组织中的表达；2）利于血管平滑肌细胞合成ROS；3）可阻滞血管新生；4）能通过刺激反应，使平滑肌实现大量增值以及迁移的效果；5）可加快血管新内膜形成的速度。

因心血管类疾病的发生，使得机体组织受损，并打破了内皮损伤与修复这两者之间的平衡，使得患者病情难以得到较好的控制。对此，诸多医学专家作出了这样的一个推测，即：可否利用C反应蛋白，实现降低EPC功能活性的效果，以通过抑制血管再生修复能力的方式，达到加快缺血性疾病发展速度的这一目的。有研究，表明：C反应蛋白在EPC（前提条件：已经通过VEGF诱导）中可表现出较强的抑制能力。由此可见，C反应蛋白的合理应用，可起到抑制EPC迁移的作用。此外，C反应蛋白也可通过另外一种机制（即：下调eNOS表达），来达到降低EPC形成与存活能力的目的。

本次研究的结果，充分表明：C反应蛋白浓度越高，CRP组的内祖皮活性以及形成能力越弱。组间差异明显，具有统计学意义（P＜0. 05）。

综上所述，C反应蛋白［7］在人体功能组织中发挥着较强的作用，具体表现在两方面上：1）可使血管内皮细胞功能出现紊乱症状；2）能大大降低EPC功能活性，让血管再生修复机制受阻，利于缺血性疾病的进一步发展。故，我们可利用C反应蛋白，对动脉粥样硬化类疾病进行有效的防治。

［1］赵薇，杨向红.C反应蛋白对大鼠骨髓内皮祖细胞参与血管形成的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2011，19（2）：105-109.

［2］肖暖.血管内皮祖细胞的分离培养分化及其高血压病的相关性研究［D］.河北医科大学，2014.

［3］陈爱华，何非，程婧等.C反应蛋白对人外周血来源内皮祖细胞Notch信号通路表达影响的实验研究［J］.南方医科大学学报，2012，32（2）：239-242.

［4］程何祥，许旭东，张荣庆等.恒磁场对C-反应蛋白作用下大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡及一氧化氮分泌的影响［J］.中华物理医学与康复杂志，2009，31（2）：88-90.

［5］何晋，陈晓彬，郑昭芬等.C反应蛋白诱导外周血内皮祖细胞衰老及非诺贝特的保护作用［J］.中国动脉硬化杂志，2012，20（1）：42-46.

［6］何晋，陈晓彬，郑昭芬等.非诺贝特对C-反应蛋白诱导的外周血内皮祖细胞损伤的保护作用［J］.医学临床研究，2011，28（5）：853-856.

［7］哈小琴，他维玮，彭俊华等.外周血内皮祖细胞预测重症急性胰腺炎意义的研究［J］.国际检验医学杂志，2012，33（20）：2446-2449.

R-3

A

1674-2060（2016）02-0119-02

何延政