五味子多糖对SMMC-7721肝癌细胞凋亡的影响

2016-10-27孙雨薇闫冬梅

生物技术世界 2016年3期

关键词：五味子抑制率多糖

孙雨薇闫冬梅

（1.中国人民解放军第209医院黑龙江牡丹江 157011；2.佳木斯大学基础医学院免疫教研室黑龙江佳木斯 154007）

五味子多糖对SMMC-7721肝癌细胞凋亡的影响

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（1.中国人民解放军第209医院黑龙江牡丹江 157011；2.佳木斯大学基础医学院免疫教研室黑龙江佳木斯 154007）

［目的］研究五味子多糖（SCP）对肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。［方法］不同浓度SCP作用于SMMC-7721，cck-8法检测药物对细胞增殖的影响；Tunnel检测细胞凋亡变化。［结果］SCP能够抑制肝癌细胞的增殖。荧光显微镜下可见细胞呈现典型的凋亡细胞形态。［结论］SCP能抑制肝癌细胞的增殖，诱导凋亡。但详细机制尚需进一步研究。

五味子多糖 SMMC-7721细胞细胞凋亡

五味子多糖（SCP）是中药五味子的主要有效成分之一,具有较好的抑瘤作用［1］。本研究探讨SCP对SMMC-7721细胞增殖及凋亡的影响,从而为肝癌的治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞株

人肝癌SMMC-7721细胞株,本研究室保存。

1.2 药品

SCP购自宁夏宏德生物制品有限公司,用RPMI 1640培养液溶解成 200 mg/mL的储备液,过滤除菌, 4 ℃保存,实验时加培养液稀释至所需浓度。

1.3 试剂

RPMI 1640购自美国Hyclone 公司,新生牛血清购自杭州四季青公司,胰蛋白酶、CCK-8、Tunnel试剂盒、Hoechst33342购于碧云天生物技术研究所。

1.4 主要仪器

MCO-15AC恒温CO2培养箱（日本SANYO公司）；Nikon ECLIPSE 80i荧光显微镜、DXM 1200 C数码相机（尼康公司）；Multiskan Mk3酶标仪（Thermo公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

SMMC-7721细胞培养于含10%灭活新生牛血清RPMI 1640培养基,37 ℃、5% CO2饱和湿度下常规培养,0.25%胰蛋白酶消化传代,每2-3 d传代1 次。

2.2 CCK-8法检测细胞增殖

SMMC-7721细胞经胰酶消化,以5×105个/mL接种于96孔板,每孔200 μL,37℃、5%CO2培养。当细胞融合达80%时,分别加入SCP（终质量浓度为0,0.625,1.25,2.5,5,10,20 mg/mL）,每个浓度3复孔,分别培养24,48,72 h加入CCK-8试剂,每孔20 μL,继续培养3 h,450 nm波长检测各孔A （吸光度）值,实验重复3次。计算细胞生长抑制率（IR）：IR（%）=（1- 实验组A均值/对照组A均值）×100%。计算各组药物的半数抑制率 IC50。

图1 给药48 h后SMMC-7721细胞凋亡结果（Tunnel染色）

2.3 Tunel染色法检测细胞凋亡

SMMC-7721细胞接种于6孔板中,每孔加3 mL培养液,于37℃、5%CO2培养。分为SCP组（10 mg/mL）和对照组（SMMC-7721）,每组3复孔。培养48 h,PBS洗涤细胞,4%多聚甲醛固定30 min； PBS洗涤,加入0.1% TritonX-100 PBS冰浴2 min。PBS洗涤细胞后移入湿盒中,加入100 μL的Tunnel检测液（现配现用）,37℃避光60 min。PBS洗涤细胞,37℃下Hoechst33342染色40 min；PBS洗涤,荧光显微镜观察细胞凋亡情况,拍照。

2.4 统计学分析

3 结果

3.1 SCP对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用

各剂量组SCP对SMMC-7721细胞生长均有抑制作用,呈现一定程度的剂量依赖性,差异有统计学意义（ P＜0.001或 P＜0.01）。5 mg/mL以上抑制率随时间延长而逐渐提高,呈时间依赖性。10 mg/mL SCP在48、72 h抑制率分别为51.59%、60.14%,20 mg/ mL SCP在24、48、72 h的抑制率分别达到67.08%、79.99%、92.44%,说明SCP体外对SMMC-7721细胞确实具有抑制作用。经计算,24, 48,72 h的 IC50分别为16.48,11.12,9.09 mg/mL,故后续实验使用浓度为10 mg/mL的剂量,药物作用时间为48 h。

3.2 SCP对凋亡细胞形态学的影响

荧光显微镜下可见,对照组细胞核染色正常,极少有标记凋亡细胞的绿色荧光；给药组细胞核基本没有破裂,但能观察到较多标记凋亡细胞的绿色荧光（图1）。