IGF-1R抑制剂NVP-AEW541在肾上腺皮质癌SW13细胞系中的作用

林登强，徐烈雨，廉建坡，王晓晶，何竑超，王卫庆，宁　光，祝　宇

(上海交通大学医学院附属瑞金医院：1.泌尿外科；2.内分泌科，上海　200025)



·基础研究·

IGF-1R抑制剂NVP-AEW541在肾上腺皮质癌SW13细胞系中的作用

林登强1，徐烈雨1，廉建坡1，王晓晶1，何竑超1，王卫庆2，宁光2，祝宇1

(上海交通大学医学院附属瑞金医院：1.泌尿外科；2.内分泌科，上海200025)

目的通过细胞实验，探寻IGF-1R抑制剂NVP-AEW541阻断IGFR信号通路的激活，评价其对SW13细胞增殖、凋亡的影响情况。 方法通过MTT试验观察细胞增殖，通过流式细胞仪检测细胞凋亡的改变，通过Western blot检测IGFR下游信号通路成员ERK和mTOR的表达情况。 结果NVP-AEW541可以呈浓度-时间依赖性抑制细胞增殖、呈浓度依赖性促进细胞早期凋亡和晚期坏死，并下调p-AKT的表达水平，而不影响mTOR的磷酸化水平和RAS/RAF/ERK信号传导通路。结论IGF-1R抑制剂NVP-AEW541可以通过下调AKT的磷酸化水平，从而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，具有潜在的抗肿瘤作用。

SW13;NVP-AEW541;胰岛素样生长因子;PI3K信号通路

肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma，ACC)是起源于肾上腺皮质细胞的恶性肿瘤，临床罕见，发病率约为0.7～2.0/106人[1]。该病恶性程度高、侵袭性强，但由于缺乏特异性诊断指标，常常造成早期诊治困难。目前针对早期ACC，手术切除是最有效的方法，尤以根治性手术为主，但因缺乏有效的辅助治疗，导致术后复发率高、远处转移率高、预后差，平均生存期仅有18个月[2]。而晚期或全身复发的患者，以药物治疗为主，尤其是米托坦，但总体疗效欠佳。因此，寻求一种有效的治疗方式，始终是研究人员密切关注的焦点。

近来研究表明，肿瘤细胞能够通过自分泌或者旁分泌途径大量表达胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factors-1，IGF-1)[3]，并通过活化胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factors-1 receptor,IGF-1R)，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，在肿瘤发生、发展中发挥至关重要的作用[4]。同时，在结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤中均发现IGF-1R过表达与预后呈负相关[5-7]。值得注意的是，胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)在正常肾上腺的形成、发育中同样发挥重要的作用[8]。并且ACC细胞也能通过自分泌或旁分泌途径过表达IGF-2和IGF-1R[9]。而IGF-1R抑制剂被认为是肾上腺皮质癌最有效的靶向治疗药物[10]。因此，本研究通过体外实验，重点探讨运用IGFR选择性抑制剂NVP-AEW541阻断IGFs的作用效果，评价对ACC细胞增殖、凋亡、下游信号通路和细胞周期的影响程度，旨在为临床提供新的可能治疗方案。

1　材料与方法

1.1材料SW-13细胞株(中科院上海生化细胞所)、IGF-1R抑制剂NVP-AEW541(美国selleck公司)，兔抗人ERK、mTOR、p-ERK和p-mTOR单克隆抗体(美国CST公司)、含10%(体积分数)胎牛血清和1%双抗的改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle mediumDMEM)(美国Gibco公司)、MTT和DMSO(美国Sigma公司)、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(美国BD公司)；培养箱(德国Heraus公司)、OLYMPUS BX50型双目显微镜(日本OLYMPUS公司)、电泳仪(上海Tanon公司)、流式细胞仪(美国Beckton Dickson公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养含10%(体积分数)的胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2、90%湿度的恒温孵箱内常规培养，每3 d传代1次。

1.2.2MTT实验将对数生长期的SW13细胞接种于96孔板(6.0×103/孔)，完全贴壁后加入药物，浓度分别是0.1、1.0、5.0、10.0 μmol/L，周围30孔加入PBS溶液200 μL/孔预防边缘效应，孵箱培养24、48、72 h后行MTT测定细胞活性。加入10%MTT(200 μL/孔)，避光培养4 h，弃去培养液，加入DMSO(100 μL/孔)，摇床震荡10 min，于酶标仪450 nm波长条件下检测各组吸光度，处理数据、绘制曲线。每组5个复孔，设置空白对照组，实验重复3次。

1.2.3Annexin-V/PI双标记法检测细胞凋亡将对数生长期的细胞接种于6孔板(3.5×105/孔)，并加入药物，浓度分别是2.0、5.0 μmol/L，孵箱培养24 h后，加入0.025%胰酶200 μL/孔消化30 s左右，加入1 mL培养液终止消化，离心处理5 min(14 000 r/min)，弃去上清，加入binding buffer(60 μL/管)重悬细胞和Annexin-V(5 μL)，避光10 min；上机前5 min，加入PI，补充binding buffer(100 μL/管)，流式细胞仪检测细胞凋亡。每组3个复孔，设置空白对照组，实验重复3次。

1.2.4Western blot细胞收获前0.5 h向6孔板内加入50 μg/L浓度的IGF-1。随后配制裂解液(RIPA、cocktail 、PMSF体积比100∶10∶1)，处理对应的细胞，4 ℃冰箱裂解30 min，刮取干净后放入离心机(4 ℃、13 000 r/min，30 min)离心处理，取上清液，并加入loading buffer，温育10 min，-20℃保存待用。SDS聚丙酰胺凝胶电泳分离相应蛋白，250 mA恒流转膜2 h，5%BSA封闭处理1 h，加入一抗，摇床处理20 min，4 ℃过夜，PBST溶液洗涤4次(5 min/次)，加入二抗(3%BSA稀释1∶10 000)，相同方法洗涤4次后机器显影。重复3次实验。

2　结　果

2.1NVP-AEW541呈浓度-时间依赖性抑制SW13细胞增殖通过MTT实验发现，NVP-AEW541可以抑制SW13细胞增殖，并呈浓度-时间依赖性关系(图1)。其中，各组结果与空白对照组结果均存在差异，且具有统计学意义(P<0.05)。处理72 h，NVP-AEW541的IC50浓度为1.06 μmol/L。当浓度增加到10.0 μmol/L,几乎完全抑制SW13细胞的增殖行为。

图1　MTT实验结果

2.2NVP-AEW541呈浓度依赖性诱导SW13细胞凋亡通过Annexin-V/PI双标记法检测细胞凋亡发现，NVP-AEW541可以诱导SW13细胞的凋亡，并呈浓度依赖性(图2)。其中，空白组、2 μmol/L实验组和5 μmol/L实验组的早期凋亡率(Annexin-V+/PI-)和晚期凋亡率或坏死率分别是(3.14±0.41)%、(4.20±0.28)%、(6.07±0.32)%和(0.97±0.60)%、(1.67±0.65)%、(2.96±0.90)%。与空白组相比，两组早期凋亡率分别是其1.34倍、1.93倍，而晚期则分别是其1.72倍、3.04倍。因此， NVP-AEW541呈浓度依赖性诱导SW13细胞早期凋亡和晚期坏死，尤其是早期细胞凋亡更为显著。

2.3NVP-AEW541对IGFR下游信号通路的影响RAS/RAF/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路是IGFs下游最主要的两条信号转导通路，因此我们通过Western blot半定量检测下游信号通路成员的表达情况，发现相比空白组，加入IGF-1的对照组中，p-AKT水平明显升高；而加入NVP-AEW541后，实验组AKT磷酸化水平显著降低，几乎完全受抑制；而(p-)MEK、(p-)ERK并无明显改变(图3)。结果提示，NVP-AEW541可以通过下调AKT的磷酸化水平而影响PI3K信号通路，从而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。

图2AnnexinV/PI双标记法检测凋亡结果

AnnexinV(+)/PI(-)和AnnexinV(+)/PI(+)分别代表早期凋亡和晚期凋亡或坏死。

治疗组和对照组间的比较，*P<0.05。

图3Western blot结果

3　讨　论

肾上腺皮质癌是临床罕见而恶性程度高的肿瘤。根治性手术切除是唯一可以治愈ACC的途径，然而术后的复发率却高达60%[11]，并且复发后，肿瘤的侵袭性增强，更易于发生转移。而对于无法进行手术的患者，米托坦是最常用、反应率最高的药物[12]。但WOOTEN等[13]对551例使用米托坦的患者进行随访跟踪1～205个月，发现米托坦的总体反应率仅为35%。由于ACC细胞具有多重耐药性，长期使用米托坦将导致药效减弱，目前临床建议米托坦与细胞毒性药物联用的化疗方案，常用的是EDP-M(依托泊苷、多柔比星、顺铂、米托坦)和Sz-M(链脲霉素、米托坦)两种方案。然而，两者的治疗效果同样不尽如人意，患者的总体生存期仅有14.8个月。因此，寻找疗效佳、耐受性好的药物，特别是靶向治疗药物，已成为当下的研究热点。

研究显示，IGFs信号网络在多种肿瘤的发生、发展中发挥至关重要的作用。而在肾上腺皮质功能发展和维持过程中，IGFs系统同样具有重要价值。大约90%的ACC存在IGF-2过表达现象[14]，而其过表达被认为是ACC分子水平中最具有特征性的改变[15]。IGF-2主要通过IGF-1R介导，激活下游的RAS/RAF/ERK、PI3K/AKT/mTOR和JAK/STAT信号通路，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡[16]。

因此，本研究将高效的IGF-1R抑制剂——NVP-AEW541应用于SW13细胞系， 通过MTT试验发现NVP-AEW541能以浓度-时间依赖性显著抑制SW13细胞的增殖，当作用72 h时，NVP-AEW541对细胞增殖的IC50为1.06 μmol/L；当浓度增加到10.0 μmol/L,几乎完全抑制SW13细胞的增殖行为。

我们进一步通过流式细胞学检测发现，NVP-AEW541同样可以呈浓度相关性诱导细胞凋亡。与空白组相比，2 μmol/L和5 μmol/L两个NVP-AEW541处理组早期凋亡率分别是其1.34倍、1.93倍，而晚期分别是其1.72倍、3.04倍。比较每组的早、晚期细胞凋亡率，发现NVP-AEW541对细胞早期凋亡的影响更为显著。

IGF1作用于IGF-1R胞外α亚基，促发构象改变，导致胞内β亚基自身酪氨酸磷酸化，随即通过RAS/RAF/ERK、PI3K/AKT/mTOR信号转导通路，促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。因此，我们通过Western blot检测ERK、mTOR等蛋白的表达情况，探寻NVP-AEW541在抑制SW13增殖、诱导凋亡中的分子作用机制。研究结果显示，p-AKT的表达水平呈NVP-AEW541浓度依赖性降低，而RAS/RAF/ERK通路并无明显改变。提示NVP-AEW541抑制IGF-1R活性，进一步阻断AKT的磷酸化，进而影响细胞的增殖和凋亡。有意思的是，本研究并未发现AKT下游靶点mTOR的磷酸化水平降低。分析可能的原因是：①NVP-AEW541可以激活mTOR代偿性激活通路，从而保证mTOR水平不受影响；②AKT下游靶点众多，包括NF-κB、MDM2等，而NVP-AEW541抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用并不依赖于mTOR的活化。先前已有研究表明在人肾上腺皮质癌H295R细胞系中，IGFs能够激活肿瘤的“逃逸机制”,免遭mTOR抑制剂的作用[17]。而结合我们的研究，提示IGF-1R和mTOR抑制剂或许具有协同治疗ACC的作用。

综上所述，本研究从体外实验证实IGF-1R抑制剂NVP-AEW541可以通过下调AKT的磷酸化水平，呈浓度依赖性促进SW13细胞系凋亡(尤其是早期细胞凋亡)、抑制细胞增殖，具有潜在的抗肿瘤作用。并且对深入探寻针对ACC的靶向治疗药物具有一定的参考价值，包括后期的体内实验和临床研究。ACC的发生可能与多条信号通路的激活有关，提示未来的研究方向，可以重点考察多靶点联合抑制剂(尤其是mTOR抑制剂)对于ACC的治疗效果或者运用更为高效的IGF-1R抑制剂。

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(编辑王玮)

The effect of IGF-1R inhibitor NVP-AEW541 on adrenocortical carcinoma SW13 cell line

LIN Deng-qiang1,XU Lie-yu1,LIAN Jian-po1,WANG Xiao-jing1,HE Hong-chao1, WANG Wei-qing2, NING Guang2, ZHU Yu1

(1.Department of Urology，2.Department of Endocrinology, Ruijin Hospital Affiliated to Medical School of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China)

ObjectiveTo explore the effect of NVP-AEW541 on adrenocortical carcinoma(ACC) cell line SW13 in vitro.MethodsAfter SW13 cells were treated with NVP-AEW541,the proliferation and apoptosis were detected with MTT assay and flow cytometryrespectively. The expressions of ERK and mTOR were detected with Western blotting. ResultsNVP-AEW541inhibitedtheproliferationin a dose- and time-dependent manner, promotedtheapoptosis in a dose-dependent manner, down-regulatedthelevel of p-AKT protein expression, but did not affect the expression of p-mTOR protein and RAS/RAF/ERK signaling pathway. ConclusionsNVP-AEW541 is effective to inhibit SW13 proliferation and promote SW13 apoptosis by reducing the expression level of p-AKT. It has anti-tumor potential.

SW13; NVP-AEW541; insulin-like growth factor; PI3K signaling pathway

2016-05-24

2016-07-18

国家自然科学基金(No.81272936)，上海市科委医学引导项目基金(No.134119a2700)

祝宇，主任医师，博士生导师.E-mail：zyyyhyq@126.com

林登强(1991-)，男(汉族)，学士学位，在读硕士研究生.研究方向：泌尿系肿瘤.E-mail：ldq888@foxmail.com

R736.6

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.09.016