响应面分析白灵菇菌糠发酵饲料加工调制与优化研究

李志涛，李海燕，马腾壑，张庆乔，钟翠红，郑素月，林冬梅

（河北工程大学农学院，河北邯郸056000）



响应面分析白灵菇菌糠发酵饲料加工调制与优化研究

李志涛，李海燕，马腾壑，张庆乔，钟翠红，郑素月，林冬梅*

（河北工程大学农学院，河北邯郸056000）

为提高白灵菇菌糠发酵饲料中粗蛋白质含量，本试验以假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌为发酵液，以发酵后白灵菇菌糠粗蛋白质含量为响应值，通过响应面分析法中Plackett-Burman设计，对影响白灵菇菌糠发酵效果的相关因素进行了分析并成功筛选出主效应因子。在PB设计基础上，根据主效应因子作用大小与方向进行了爬坡试验，再进行Box-Behnken中心复合试验，对主效应因子进一步优化，建立了白灵菇菌糠发酵模型。响应面优化试验结果表明：白灵菇菌糠发酵的最佳工艺条件为白灵菇菌糠∶玉米粉质量为19.1∶1，假丝酵母菌与嗜酸乳杆菌体积比为7.0∶1，菌液接种量7.1%，料水比为2.1∶1，初始pH值为5.0。在此条件下粗蛋白质含量预测值为17.70%，验证试验得到实际粗蛋白质含量为17.41%，与理论预测值相比偏差较小。与发酵前菌糠中粗蛋白质含量相比，提高了78.6%，菌糠中假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌最大活菌数为8.7×109cfu/mL，在常温条件下贮藏60 d后，菌糠中的活菌数仍然保持在9.8×107cfu/mL，经检测菌糠中霉菌毒素含量低于国家饲料卫生安全限量标准。

白灵菇菌糠；发酵饲料；优化；模型；响应面分析

菌糠营养丰富，但极易腐败变质，若随意丢弃，会造成严重的环境污染和资源浪费。因此，探讨菌糠的资源化利用具有重要意义。研究表明，菌糠中含有大量的纤维素、半纤维素、木质素等，这些成分难以被畜禽直接消化利用，但经过生物转化处理后，可用于畜禽的饲料原料开发，此外菌糠中还富含多糖类、有机酸类及其他营养物质（潘军等，2010；邹德勋等，2009）。白灵菇是主要以玉米芯、锯木屑、棉籽壳等为营养物质的木腐型食用菌，一般生产时只收一茬菇，因此白灵菇菌糠中养分剩余率高，具有较为丰富的碳素和氮素（Shen等，2011）。

通过生物转化即可防止食用菌菌糠受到霉菌毒素污染，延长菌糠存储时间，又可改善菌糠感官品质和营养价值（Xu等，2010；Kwak等，2008）。假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌作为有益菌混合发酵，可以产生协同作用并转化农副产品如淀粉渣、啤酒糟等生成菌体蛋白，提高这些农副产品营养价值（Chu等，2012）。因此，本试验以假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌作为发酵菌种，通过Plackett－Burman与中心复合试验优化发酵条件，以提高白灵菇菌糠的营养价值，改善其感官品质，为工业化生产菌糠饲料提供参考。

表1　PB试验设计因素及水平

1　材料与方法

1.1材料白灵菇菌糠：邯郸市荣珍食用菌合作社提供。

菌种：高活性干酵母粉，由安琪酵母股份有限公司提供，粉末固体，活菌量＞4×109cfu/g。嗜酸乳杆菌粉，由常州生物科技有限公司提供，粉末状固体，活菌量＞4×109cfu/g。

发酵袋：具有单向排气阀装置，规格30 cm× 20 cm，袋装容量1000 g。

1.2白灵菇菌糠营养成分分析收集无污染、无霉变的白灵菇菌糠进行粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪、无氮浸出物、还原糖和灰分测定。测定方法依据饲料分析检测常规方法进行。

1.3白灵菇菌糠发酵饲料制备

1.3.1菌糠预处理将选取的白灵菇于65℃烘干，粉碎后过60目筛，按比例加入玉米粉充分混合，将其作为发酵原料，121℃高压灭菌30 min后，装入发酵袋中待用。

1.3.2菌液制备假丝酵母菌液制备方法：配质量浓度为5 g/L葡萄糖活化溶液，调温至35℃，将高活性干酵母粉按照质量比溶解于活化液中，在33～35℃下活化1 h，得到假丝酵母菌液。

嗜酸乳杆菌液制备方法：配质量浓度为5 g/L葡萄糖活化溶液，调温至40℃，将嗜酸乳杆菌粉按照质量比溶解于活化液中，在37～40℃下活化30 min，得到嗜酸乳杆菌液。

混合菌液制备：将假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液按照质量比混合均匀，得到混合菌液。

1.3.3发酵在发酵袋中按比例接入混合菌液，并按比例补充水分，调节pH值，密封后在设定温度下发酵，按时取样测定，检验发酵效果。

1.4方法

1.4.1Plackett-Burman试验关键因子筛选采用Plackett-Burman设计法对影响白灵菇菌糠发酵后粗蛋白质含量的9个影响因素进行筛选，选用试验次数N＝12的试验设计，影响因素及水平见表1。

1.4.2最陡爬坡试验响应面拟合方程只有在接近最佳值区域才近似真实情况，因此要先逼近此区域才能建立有效的响应面拟合方程，通常用最陡爬坡法快速的逼近最佳值区域。最陡爬坡法以Plackett-Burman试验结果为依据，爬坡路径与主要因素的效应一致（李立英等，2012）。

1.4.3发酵条件的中心组合优化采用响应面中心组合设计（Box-Behnken Design），对影响白灵菇菌糠发酵后粗蛋白质含量的显著影响因子进一步优化，根据Plackett-Burman和最陡爬坡法试验结果，结合因素的效应大小和试验中的实际情况，选择下一步试验水平的中心点和各水平的步长，响应值为白灵菇菌糠粗蛋白质含量，各因素和水平见表2。

表2　BBD试验设计因素及代码水平

2　结果与分析

2.1Plackett-Burman试验关键因子筛选运用SAS软件对Plackett-Burman设计进行分析，由表3和表4可知，模型Pr＞F=0.0260 0＜0.05，表明响应面回归模型为显著水平，模型的校正系数R2＝0.9942，表明该模型方程拟合程度良好。模型的修正系数R2Adj=0.9679，表明该模型较好地反映了各因素之间的关系。各因素对白灵菇菌糠粗蛋白质含量影响的大小顺序为：X2、X6、X5、X1、X3、X8、X9、X7、X4（按效应绝对值大小排序），其中X2达到极显著水平，X1、X3、X5、X6呈显著水平，X1、X2、X3、X7、X8呈正效应，而X4、X5、X6、X9呈负效应。因此确定X1、X2、X3、X5、X6为5个主要因素进行最陡爬坡试验和Box-Behnken试验设计。Plackett-Burman试验设计回归方程为：

表3　Plackett-Burman试验设计与结果

表4　Plackett-Burman设计回归方程系数及其显著性检验

2.2最陡爬坡试验根据Plackett-Bueman试验结果筛选出5个主要因素效应值的正负大小，设计爬坡方向和步长进行最陡爬坡试验以逼近最大区域。由表5可知，白灵菇菌糠粗蛋白质含量在试验5附近，故以第5组试验条件为水平中心点进行响应面设计。

表5　爬坡试验设计及结果

2.3发酵条件中心组合优化在最陡爬坡试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取X1、X2、X3、X5、X6进行五因素三水平的响应面分析试验，以白灵菇菌糠粗蛋白质含量（Y）为响应值，结果见表6。

表6　Box-Behnken试验设计与结果

采用SAS软件对试验数据进行回归分析，由此可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联式，得到回归方程式：

对该回归模型进行方差分析，结果见表7。由此可知模型Pr＞F=0.0001，表明响应面回归模型达到了极显著水平，模型的校正系数R=0.8200，说明该方程拟合程度良好。通过对回归方程的方差分析得出，一次项X5，二次项X12、X22、X32、X52、X62和交互项X1X3、X1X6对白灵菇菌糠粗蛋白质含量的影响是显著的，各试验因子对白灵菇菌糠粗蛋白质含量的影响为非线性关系。

表7　回归模型方差分析

根据上述回归方程和回归模型方差分析绘出响应曲面（图1）。两因素之间的影响呈抛物线型关系，且均有一个极大值点，变化趋势先增大后减小。通过求解回归方程得到白灵菇菌糠发酵饲料的最佳工艺条件为：白灵菇菌糠和玉米粉用量比19.111∶1、假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液用量比7.005∶1、菌液接种量7.078%、料水比2.110∶1、初始pH值4.998，该条件下白灵菇菌糠粗蛋白质含量的预测值是17.70%。考虑到实际操作，将试验的条件修改为白灵菇菌糠和玉米粉用量比19.1∶1、假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液用量比7.0∶1、菌液接种量7.1%、料水比2.1∶1、初始pH值5.0。

图1　试验因子交互作用对粗蛋白质含量的影响

2.4优化条件下白灵菇菌糠发酵饲料验证结果在最佳组合条件下重复试验3次，测定实际白灵菇菌糠粗蛋白质含量为17.41%，与预测值（17.70%）基本吻合，说明得到的回归模型和实际情况拟合较好，进一步验证了该模型具有实用价值。白灵菇菌糠发酵前与发酵后得到的熟料干燥后制成饲料颗粒成品营养含量和感官品质对比见表8。

表8　菌糠发酵前后营养成分对比

3　讨论

本试验通过以白灵菇菌糠为发酵原料，接入混合菌种进行厌氧发酵，研究其制作发酵饲料的工艺条件。通过响应面分析法中Plackett-Burman试验设计，对影响白灵菇菌糠发酵效果的诸多相关因素进行了分析并成功筛选出主效应因子，在Plackett-Burman设计基础上，根据主效应因子作用大小与方向进行了爬坡试验，通过Box-Behnken Design中心复合试验，对主效应因子进一步优化。得到的利用白灵菇菌糠制备发酵饲料的最佳工艺条件为：白灵菇菌糠和玉米粉用量比19.1∶1、假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液用量比7.0∶1、菌液接种量7.1%、料水比2.1∶1和初始pH值5.0。本研究结果表明，通过优化白灵菇菌糠发酵条件，能改善白灵菇菌糠营养价值和感官品质。Kwak等（2008）研究报道，通过接种微生物发酵，会降低菌糠的pH值（pH＜4.5）。菌糠处于低pH下，可以防止菌糠中霉菌毒素的大量转化，避免菌糠的腐败变质，从而延长菌糠的存储时间和质量（郑有坤等，2013；任天宝等，2011）。本试验所得结果与前人研究一致，通过在白灵菇菌糠中添加假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌混合发酵，白灵菇菌糠pH值明显降低，同时产生浓郁的发酵香味，改善了白灵菇菌糠饲料的感官品质。菌糠中假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌最大活菌数为8.7× 109cfu/mL，在常温条件下贮藏60 d后，菌糠中的活菌数仍然保持在9.8×107cfu/mL，同时菌糠中霉菌毒素含量远低于国家饲料卫生安全限量标准。

食用菌营养方式多种多样，所用培养基原料组成不尽相同，研究菌糠的营养成分及含量有助于有效利用这类废弃物资源（Marshall，1992）。Shen等（2011）发现以玉米芯和锯木屑为栽培原料的培养基在白灵菇生长过程中木质素、纤维素、半纤维素的分解率分别为80.38%、69.03%、59.72%。Kwak（2008）等利用酵母菌和乳酸菌对秸秆菌糠进行混合发酵，发现能显著提高菌糠的粗蛋白质含量。这是因为在发酵过程中，菌糠中有益菌分解多种胞内酶和胞外酶，使纤维素、半纤维素和木质素中分子链长、分子量大的化合物被降解成小分子化合物，一些营养物质被释放出来（Li等，2001）。本研究显示，经过发酵处理，白灵菇菌糠的粗纤维含量降低，无氮浸出物和粗蛋白质含量增高，使得白灵菇菌糠的饲料应用潜力进一步增加。

4　结论

白灵菇菌糠制作发酵饲料最佳制备工艺条件为：白灵菇菌糠和玉米粉用量比19.1∶1、假丝酵母菌液和嗜酸乳杆菌液用量比7.0∶1、菌液接种量7.1%、料水比2.1∶1、初始pH值5.0。在此条件下测得菌糠发酵饲料中粗蛋白质平均含量为17.41%，与理论预测值相比，相对误差仅为0.29%，说明模型能较好地预测白灵菇菌糠发酵饲料粗蛋白质产量，具有较好的生产指导意义。

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The present research boosted crude protein in pleurotus nebrodensis residues through fermentation with Candida albicans and Lactobacillus acidophilus，and then with crude protein of the fermented residues as the response value，Plackett-Burman design（PBD）and response surface methodology（RSM）were applied to identify the numerous variables influencing the fermentation process and the essential factors were screened.Based on Plackett-Burman design，Box-Behnken Design method was adopted following a slope-climbing test on the direction and magnitude of the main effect factors to optimize these crucial factors and thus a model for pleurotus nebrodensis residues fermentation was eatablished.The optimal levels and interactions of the significant factors found for the fermentation process using RSM was 19.1∶1 for the mass ratio of pleurotus nebrodensis residue to corn flour，7.0∶1 for the volume ratio of Candida albicans to Lactobacillus acidophilus，7.1%for the inoculation of bacteria solution，2.1∶1 for the ratio of material to water，and 5.0 for the initial pH value.Under these optimized conditions，the predicted value of crude protein was 17.70%and the observed experimental result was17.41%.The observed and predicated values were regarded to be relatively close.The fermented residues presented an increase of 78.6%in crude protein content，while the maximum viable count of Candida albicans and Lactobacillus acidophilus reached 8.7×109cfu/mL.The viable count stood at 9.8×107cfu/mL after storage at room temperature for 60 days，with mycotoxin content within the national limit of feed safety.

pleurotus nebrodensis residues；fermented feed；optimization；models；RSM

S816.6

A

1004-3314（2016）05-0033-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160508

河北省现代农业产业技术体系食用菌产业创新团队建设专项基金