发酵食品乳酸菌分离鉴定及功能特性研究

任大勇，荣凤君，宫圣洁，朱剑威，张振业，刘宏妍，于寒松

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118）

发酵食品乳酸菌分离鉴定及功能特性研究

任大勇1，荣凤君1，宫圣洁1，朱剑威1，张振业1，刘宏妍2，于寒松1

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118）

对发酵食品中分离出的7株乳酸菌进行了亚硝酸钠、乳糖、胆固醇降解试验、抗氧化活性试验和抑菌试验，筛选出益生功能较强的乳酸菌菌株。结果表明：菌株A1对亚硝酸钠和胆固醇的降解率都是最高，分别为91.8%和56.6%，对乳糖降解率最高的是A2，降解率为73.9%，菌株A2对亚硝酸钠的降解率也超过90%。3种抗氧化试验的结果各不相同，自由基清除率最高的是A4，为94.6%；羟基清除率最高的是A7，为40.9%；亚铁离子清除率最高的是A1，为71.1%。经过100℃处理后的乳酸菌抑菌效果没有发生太大的改变；经酶处理后，加入胃蛋白酶和胰蛋白酶的A6菌液对大肠杆菌，没有产生抑菌效果。

乳酸菌；亚硝酸钠；胆固醇；乳糖；抑菌试验

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类能在可发酵碳水化合物中产大量乳酸的一类细菌的统称。这类益生菌在很多领域中有着很高的应用价值，例如它们可以用于发酵乳制品、发酵蔬菜、酸面包、青贮材料、微生物饲料添加剂等［1］，乳酸菌细胞染色多呈革兰氏阳性，有球状和杆状两种菌体形态，不形成内生孢子，无运动性［2］。大量研究表明，乳酸菌能促进营养成分的吸收、分解；能够保持微生态平衡，调节机体胃肠道正常菌群，抑菌抗病，健胃整肠，提高食物生物价和消化率，维持和改善机体正常机能；增强免疫功能；降低血清胆固醇；具有抗癌功能；乳酸菌还可提高食品的储藏性能，延长其储藏期［3-5］。

本试验对发酵食品中乳酸菌进行研究，对乳酸菌的抑菌作用、耐胆盐和降解亚硝酸钠、降胆固醇等特点并发挥其潜在的功能，寻找到品质优良而且高效能耐胆盐、降解亚硝酸钠、降胆固醇等的乳酸菌菌种应用食品加工方面，更好的利用到我们的生产、生活当中具有重要意义。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1材料

农家腌制的酸菜和辣白菜：置于无菌袋内，经4℃储藏、密封、运输到实验室。

1.1.2菌种

大肠杆菌（Escherichia coli）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus.Frankland）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）菌株：由吉林农业大学食品科学与工程学院毒理学试验室分离并保存。

1.1.3试剂

MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、吐温-80 1.0 mL、磷酸氢二钾2.0 g、柠檬酸氢二铵2.0 g、乙酸钠5.0 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、琼脂15 g加蒸馏水1 000 mL，调节pH（6.2±0.2）（加琼脂为液体培养基）。

MRS-乳糖培养基：将MRS培养基中的葡萄糖替换成为乳糖浓度为4.6%，与牛奶相当。

MRS-胆固醇培养基：MRS培养基中添加0.2%巯基乙酸钠、0.3%牛胆盐，并加入胆固醇使体系中胆固醇浓度为100 μL/mL。

LB培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸出物5.0 g、氯化钠10.0 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1 000 mL。

PBS缓冲液：磷酸二氢钾0.27 g、硫酸二氢钠1.42 g、氯化钠8 g、氯化钾0.2 g加入800 mL蒸馏水充分搅拌，然后加入浓盐酸调制需要的pH，最后定容到1 000 mL。

盐酸萘乙二胺、硫酸锌、对氨基苯磺酸、浓盐酸、亚硝酸钠、乙醇、氢氧化钾、正己烷、邻苯二甲醛-冰醋酸、浓硫酸、蒽酮硫酸、Tris-Hcl缓冲液、邻苯三酚、O-菲啰啉、硫酸亚铁、双氧水、抗坏血酸、氢氧化钠、三氯乙酸、氯化钠、蒸馏水。

1.1.4仪器

离心机：上海安亭科学仪器厂；电热恒温培养箱：湖北省黄石市医疗器械厂；电子天平：上海佑科仪器表有限公司；Delta320 pH计：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电热恒温水浴锅：上海新苗医疗器械制造有限公司；KYC-100B空气恒温摇床、净化工作台：上海新苗医疗器械制造有限公司；漏斗，滤纸，玻璃棒，培养皿，试管，试管架，移液枪，三角锥瓶，镊子，牛津杯。

1.2方法

1.2.1分离

1.2.1.1样品处理

从样品中各取1 g，分别加入到10 mL灭菌后的离心管内，并加入9 mL的蒸馏水进行稀释，将样品按照10倍梯度稀释。

1.2.1.2分离纯化

取100 μL稀释的样品，加入含1.6%溴甲酚绿酒精液MRS固体培养基上并涂匀，37℃恒温48 h后，培养基上如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌，挑取明显菌株用MRS液体培养基活化，进行菌株编号，37℃培养12 h后，取少量活化好的培养液，用革兰氏染色并做镜检，筛选出符合乳酸菌形态特征的菌株，镜检之后将其保存在MRS培养基中，从酸菜中筛选出的菌株命名为A1、A2、A3，从辣白菜中筛选出的菌株命名为A4、A5、A6、A7。

1.2.2降解亚硝酸钠

取1 mL浓度为0.25 mg/mL无菌亚硝酸钠溶液加入9 mL MRS肉汤培养基，在37℃厌氧条件下培养48 h，同时做空白试验。温育结束，取5 mL培养液，加入10 mL硫酸锌（0.42 mol/L）溶液，静置后过滤，以沉淀蛋白与脂肪。滤液稀释50倍，在5 mL稀释液中加入0.4%的对氨基苯磺酸（0.4 g对氨基苯磺酸溶于20 mL浓盐酸，并用蒸馏水定容至100 mL容量瓶）2 mL，静置5 min后加0.2%的盐酸萘乙二胺1 mL，充分混匀，避光显色5min后，在538 nm处测定混合溶液的OD值［6］。同时进行标准曲线的制作（亚硝酸钠含量为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL）。

式中：P1为接种乳酸菌0 h培养液中亚硝酸钠的OD值；P2为接种乳酸菌48 h后培养液中亚硝酸钠的OD值。

1.2.3同化胆固醇

将乳酸菌液按照1%的体积比加入MRS-胆固醇培养基，37℃厌氧温育24 h，并做空白试验。温育后，取1 mL菌液于EP管，12 000 r/min 4℃离心5 min，收集0.5 mL上清液，加入3 mL 95%的乙醇和2 mL 50%的KOH，振荡1 min混匀，60℃水浴10 min，使皂化完全。然后，加入5 mL正己烷混匀，静置15 min分层，取有机溶剂相（上相），加入3 mL蒸馏水振荡后静置15 min，使两相完全分离。取上相2.5 mL，80℃水浴蒸干正己烷，加入4mL邻苯二甲醛-冰醋酸溶液（0.5mg/mL）振荡1 min，静置10 min。最后，取2 mL浓硫酸终止反应，室温静置10 min，在550 nm处测其吸光值［7］。同时进行标准曲线的绘制（胆固醇浓度范围为0、10、20、30、40、50 μg/mL）。

同化率/%＝（1-P2/P1）×100

式中：P1为接种乳酸菌0 h培养液中胆固醇含量的OD值；P2为接种乳酸菌24 h后培养液中胆固醇含量的OD值。

1.2.4乳糖不耐症

向5 mL MRS-乳糖液体培养基中加入乳酸菌液200 μL，37℃温育24 h，并做空白试验。在培养液中添加0.42 mol/L的硫酸锌溶液10 mL，静置30 min，过滤。将滤液稀50倍后，在1 mL稀释液中加入4 mL 0.2%蒽酮硫酸溶液，混匀后，沸水水浴10min，冷却至室温，在620 nm处测其吸光值［8-9］。同时绘制乳糖的标准曲线（浓度为0～0.1 mg/mL）。

式中：P1为接种乳酸菌0 h培养液中乳糖含量的OD值；P2为接种乳酸菌24 h后培养液中乳糖含量的OD值。

1.2.5体外抗氧化性

1.2.5.1清除超氧自由基

将0.1 mL样品加入2.8 mL Tris-HCl缓冲液（pH= 7.2）后，加入60 mmol/L的邻苯三酚0.1 mL，37℃水浴反应5 min，加入2滴8 mol/L的HCl终止反应，于325 nm处测其OD值［10］。

式中：P1为试验组吸光度的OD值；Ps为对照组吸光度的OD值；P0为调零组吸光度的OD值。

邻苯三酚加样表如表1所示。

表1　邻苯三酚加样表Table 1Sample list of phosphorus benzene three phenol

1.2.5.2清除羟基自由基

在试管中加入2.5 mmol/L的O-菲啰啉、pH=7.4的PBS缓冲液、蒸馏水各1 mL，充分混匀后加入1 mL 2.5 mmol/L的硫酸亚铁和1 mL 0.1%的H2O2，37℃温育1 h，在536 nm处测其吸光度为P1；用1 mL蒸馏水代替1 mL H2O2的吸光值为P0；用1 mL样品代替1 mL蒸馏水的OD值为P2。

式中：P1为加入双氧水的对照组的吸光值；P0为加入蒸馏水的调零组的吸光值；P2为加入样品的试验组的吸光值。

1.2.5.3螯合亚铁离子

0.1mL样品中加入0.1 mL 1%的抗坏血酸，0.1 mL 0.4%的FeSO4和1 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液，混合均匀，于37℃水浴20 min后，三氯乙酸沉淀蛋白，4 000 r/min离心10 min，取0.2 mL上清液加入2 mL 0.1%的O-菲啰啉，反应10 min后在510 nm处测其OD值，同时做空白试验（加PBS）。

式中：P0为加PBS的体系的OD值；P1为加样品的体系的OD值。

1.2.6抑菌试验

本试验以本大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌为致病菌，进行抑菌试验。

1）取活化好的乳酸菌培养液进行12 000 r/min离心，4℃离心10 min，取上清液及上清液在100℃下保持15 min的液体，进行抑菌试验；

2）取12 000 r/min离心10 min的乳酸菌上清液，在上清液中分别加入过氧化氢酶（0.5 mg/mL）、胰蛋白酶（1 mg/mL）、胃蛋白酶（1 mg/mL），37℃水浴1 h，用于抑菌试验；

3）用镊子夹取牛津杯放到LB固体培养基上，吸取100 μL处理后的乳酸菌菌液滴加于牛津杯中，每个平板贴3个～4个牛津杯。同时，用0.15 mg/mL的头孢噻呋钠作为参比。平板于37℃恒温培养箱培养12 h后，观察有无抑菌圈，及其直径大小，比较抑菌圈大小［11］。

2结果与讨论

2.1分离菌株的测序结果

乳酸菌16SrDNA序列鉴定结果见表2。

表2　乳酸菌16SrDNA序列鉴定结果Table 2Identification results of 16SrDNA sequence of lactic acid bacteria

由表2可知，对7株菌株进行菌属鉴定，结果显示A1、A2、A3、A5菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），A4菌株为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），A6菌株为德氏乳酸杆菌（Lactobacillus delbrueckii），A7菌株为短乳酸杆菌（Lactobacillus brevis）。

2.2乳酸菌对亚硝酸钠、胆盐、乳糖降解率的影响

乳酸菌对亚硝酸钠、胆盐、乳糖的影响见表3。

表3　乳酸菌对亚硝酸钠、胆盐、乳糖的影响（n=3）Table 3Effects of lactic acid bacteria on sodium nitrite，bile salt，lactose（n=3）

从表3中可以看出，对亚硝酸钠的降解率在86.2%～91.8%之间，降解率最好的是A1，为91.8%，降解率最低的是A7，为86.2%；对胆固醇的降解率在22.8%～56.6%之间，降解率最好的是A1，为56.6%，降解率最低的是A7，为22.8%；乳糖的降解率在58.3%～73.9%之间，降解率最高的是A2，为73.9%，降解率最低的是A1，为58.3%。

2.3体外抗氧化

体外抗氧化结果比较见表4。

表4　体外抗氧化结果比较（n=3）Table 4Comparison of antioxidant activity in vitro（n=3）

从表4中可以看出，自由基清除率在80.7%～94.6%之间。清除率最高的是A4，为94.6%，清除率最低的是A2，为80.2%；羟基的清除率在6.8%～40.9%之间，清除率最好的A7，为40.9%，清除率最低的是A2，为6.8%；螯合亚铁离子的清除率在25.5%～71.1%之间，清除率最好的是A1，为71.1%，清除率最低的是A7，为25.5%。

2.4抑菌试验

乳酸菌上清液的抑菌效果如表5所示。

表5　乳酸菌上清液的抑菌效果（cm，n=3）Table 5The inhibitory effect of lactic acid bacteria supernatants（cm，n=3）

通过表5可以得出对大肠杆菌抑菌性好的菌株是A1、A6，直径分别是2.8 cm和2.6 cm；对蜡样芽孢杆菌抑菌性较好的菌株分别是A1、A6，抑菌圈的大小差不多，分别为2.4 cm和2.3 cm；对金黄色葡萄球菌抑菌性较好的菌株是A1、A3，抑菌圈直径分别为2.1、2.0 cm；对沙门氏菌的抑菌效果较好的菌株为A2、A4，抑菌圈的直径为2.0、2.1 cm。

通过抑菌试验结果，筛选出对每1株致病菌抑菌性强的两株乳酸菌进行耐热试验和酶试验，并进行结果分析，结果如表6所示。

从表6可以看出，经100℃处理后，5株乳酸菌的抑菌效果没有发生变化，还保留其抑菌活性，说明产生的抑菌物质中含有耐热物质。

表6　热处理对乳酸菌活性的影响（cm，n=3）Table 6Effect of heat treatment on the activity of lactic acid bacteria（cm，n=3）

不同酶对乳酸菌抑菌活性的影响如表7所示。

表7　不同酶对乳酸菌抑菌活性的影响（cm，n=3）Table 7Effects of different enzymes on the antibacterial activity of lactic acid bacteria（cm，n=3）

从表7中可以看出，加入胃蛋白酶、过氧化氢酶和胰蛋白酶的A1、A2、A3、A4的菌液对致病菌的影响不大，但是加入了胃蛋白酶和胰蛋白酶A6的菌液对大肠杆菌没有抑菌效果。

3结论

3.1乳酸菌对亚硝酸钠、胆固醇和乳糖降解率的比较

相同乳酸菌能产生不同的益生功能，导是其益生能力的不同。本试验采用3种不同的方法对乳酸菌益生能力进行测试，结果显示相同菌株的益生功能各不相同，原因可能是由于不同乳酸菌产生的活性物质不同；相同菌株对亚硝酸钠、胆固醇和乳糖降解能力的不同，导致益生功能的不同［12-14］。在试验的的7株乳酸菌中，A1植物乳杆菌对亚硝酸钠的降解率最高，为91.8%，对胆固醇降解率最高的也是A1植物乳杆菌，降解率为56.6%，可能是因为其益生成分相同，导致降解率的相同；对乳糖降解率最高的是A2植物乳杆菌，降解率为73.9%，对亚硝酸钠的降解率也超过90%。A1、A2两株乳酸菌可应用到功能性食品中进一步研究、开发和应用。

3.23种抗氧化方法的比较

不同菌株乳酸菌的抗氧化能力不同，同一株乳酸菌通过3种不同方法对其进行抗氧化能力测试，结果显示方法不同抗氧化能力也不相同。原因可能是由于不同乳酸菌起抗氧化作用的活性物质的不同；相同的菌株对清除羟自由基、超氧阴离子自由基及亚铁离子清楚率的能力不同，导致其抗氧化的机制有所不同［15］。在试验的7株乳酸菌中，A4唾液乳杆菌对超氧自由基清除率最高，清除率为94.6%；对羟基清除率最高的则是A7短乳杆菌，清除率为40.9%；而对亚铁离子清除率最高的则是A1植物乳杆菌，清除率为71.1%。可能是因为抗氧化成分、抗氧化机制和抗氧化条件的不同，导致其抗氧化能力的不同。

3.3抑菌试验

有大量研究证实乳酸菌对致病菌（蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）具有抑制作用，其代谢物抑菌性得到广泛应用，不同的菌株对致病菌的抑菌效果存在很大的差别［16-18］。从表5、表6、表7中可以看出，7株乳酸菌的上清液对致病菌都有不同程度明显的抑菌效果，通过致病菌对选出的菌株又进行了热处理和加酶试验，可知道筛选出的菌株的上清液含有耐热物质，加热后对抑菌效果没有太大影响；经过酶处理后，只有加入胰蛋白酶和胃蛋白酶A6德氏乳杆菌的菌液对大肠杆菌没有抑菌效果，其他经过酶处理的菌株的抑菌效果不受影响。初步推测乳酸菌产生抑菌物质是有机酸；而A6德氏乳杆菌菌株加酶后，却对大肠杆菌没有抑菌效果，可能是代谢物里含有蛋白或小肽，经酶处理后将其分解，对致病菌没有抑菌效果。

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Isolation，Identification and Functional Properties of Lactobacillus Derived from Fermented Foods

REN Da-yong1，RONG Feng-jun1，GONG Sheng-jie1，ZHU Jian-wei1，ZHANG Zhen-ye1，LIU Hong-yan2，YU Han-song1
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.College of Chinese Herbal Medicine，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China）

In this experiment，7 strains of lactic acid bacteria isolated from fermented foods were carry out lactose，sodium nitrite，cholesterol degradation，antioxidant activity and antibacterial experiment，screening of lactic acid bacteria probiotic function.The results showed：the degradation of sodium nitrite and cholesterol was the highest rate of strain A1，respectively，91.8%and 56.6%.The lactose degradation rate of A2 was the highest，the degradation rate was 73.9%，the strain A2 degradation rate of sodium nitrite was also more than 90%，threekinds of antioxidant experimental result were not the same，free radical scavenging rate of A4 was the highest，94.6%；hydroxyl radical of A7 was the highest rate was 40.9%，ferrous ion the clearance rate of A1 was the highest，71.1%，lacticacidbacteriaantibacterialeffectafter100℃treatmentwerenotmuchchanged；Aftertheenzymetreatment，A6bacteriumwasaddedtopepsinandtrypsinonEscherichiacoli，hadnoantibacterialeffect.

Lactobacillus；sodiumnitrite；cholesterol；lactose；antibacterialexperiment

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.044

2015-11-25

吉林省教育厅项目［吉教科合字（2015）第196号］

任大勇（1979—），男（汉），讲师，博士，研究方向：食品微生物。