基于络病学探讨内毒素“二次打击”急性肺损伤大鼠的Rho/ROCK机制及川芎嗪的保护作用

李　言　梁俊清　张高峰　李　佳　杨锡兰　陈前芬　赵士弟

(1 蚌埠医学院病理生理学教研室，蚌埠，233030； 2 河北以岭医药研究院有限公司，石家庄，050035)



基于络病学探讨内毒素“二次打击”急性肺损伤大鼠的Rho/ROCK机制及川芎嗪的保护作用

李言1梁俊清2张高峰1李佳1杨锡兰1陈前芬1赵士弟1

(1 蚌埠医学院病理生理学教研室，蚌埠，233030； 2 河北以岭医药研究院有限公司，石家庄，050035)

目的：研究内毒素血症“瘀滞络脉”急性肺损伤大鼠的Rho/ROCK机制及川芎嗪的保护作用。方法：以内毒素“二次打击”建立大鼠内毒素血症“瘀滞络脉”急性肺损伤模型，分别设正常对照组、模型组、川芎嗪低剂量组、高剂量组，测定呼吸频率、肺泡灌洗液中性粒细胞(PMN)百分率、肺湿/干重比、肺组织髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性、ROCK mRNA表达量，并观察、评估肺组织损伤严重程度。结果：与模型组相比，川芎嗪显著降低呼吸频率、PMN百分率、肺湿/干重比、MPO活性、ROCK mRNA表达量，减轻大鼠急性肺损伤病理改变。结论：川芎嗪可能通过抑制Rho/ROCK通路对内毒素血症“瘀滞络脉”大鼠急性肺损伤有较好的保护作用。

络病学；内毒素血症；急性肺损伤；川芎嗪；Rho/ROCK

脓毒症(Sepsis)多为内毒素血症(Endotoxemia)，是现代急诊医学面临的一个常见而复杂的难题，为全身性炎性反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)甚至多器官衰竭(Multiple Organ Failure，MOF)的前期状态，具有高死亡率、高医疗费用的特点[1]。新近发现中药单体川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)可保护脓毒症动物心肾肺功能[2-4]，但确切机制未明。因此，继承和发展络病学有关理论，深入探讨内毒素血症的发病机制和川芎嗪的保护作用，对于内毒素血症的有效防治和川芎嗪的推广应用都具有积极意义。

综合相关研究表明，内毒素血症急性肺损伤(Acute Lung Injury，ALI)，特征性病理生理学改变是肺毛细血管内皮细胞间隙形成、毛细血管内皮通透性增高，中性粒细胞黏附、迁移，通过血管内皮细胞间隙由血管向肺泡、肺间质外渗，释放大量促炎介质，由此导致中性粒细胞介导的肺损伤[5]。而Rho/Rho激酶(ROCK)信号转导途径的激活在血管内皮超微结构改变中起着关键作用[6-7]。

20世纪80年代以来，络病学理论与实践的不断进展[8-9]和内毒素血症病理机制的深入研究[10-11]，为“瘀滞络脉”病机假说提供了初步的现代生物学依据。有学者研究表明，川芎嗪有抑制Rho/ROCK信号通路的作用[12]。川芎嗪是否通过减轻骨架重构、通络排毒，防治内毒素血症？源于此，本研究基于络病学，试图揭示内毒素血症“瘀滞络脉”病机假说的现代分子生物学基础，探讨中药单体川芎嗪对内毒素血症急性肺损伤时内皮细胞骨架重构、血管内皮屏障损伤的影响及其机制。

1　材料与方法

1.1实验动物成年Wistar大鼠，体重200～250 g(蚌埠医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(皖)2011-002)，雌雄各半。

1.2试剂及仪器内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)055:B5(美国Sigma公司)；注射用盐酸川芎嗪(批号：20140403，80 mg/瓶；合肥平光制药有限公司)；呼吸频率监测仪(Model RM-80，美国Columbus Instruments)；第一条链合成试剂盒(天根生化有限公司)；PCR master mix(Fermentas公司)；MPO试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

2　方法

2.1动物模型制备将LPS溶于0.9%生理盐水(NS)制成1 mg/mL溶液备用。大鼠随机分为4组：G1(生理盐水对照组)，G2(内毒素“二次打击”组)，G3(低剂量TMP组)和G4(高剂量TMP组)。实验开始时G1组腹腔注射生理盐水1 mL/kg体重作为对照，其余各组大鼠腹腔注射LPS(1 mg/kg)进行首次打击(图1)。16 h后，所有动物经腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，仰位于60°的平板上。行颈部正中手术暴露气管，G1组气管滴注NS(1 mL/kg)，其余各组大鼠气管滴注LPS(3 mg/kg)进行二次打击；此后每只大鼠通过1 mL注射器注入0.1 mL空气[13]。大鼠滴注后垂直位旋转0.5～1 min以使滴注液均匀分布到肺部。

图1　图示动物分组和实验流程：大鼠随机分为4组(G1～G4)

注：G1(生理盐水对照组)，G2(内毒素“二次打击”组)，G3(低剂量TMP组)和G4(高剂量TMP组)。(▼:实验终点)

2.2川芎嗪应用G3和G4组在首次打击之前30 min和二次打击之后30 min，腹腔注射TMP(G3)40 mg/kg或TMP(G4)80 mg/kg生理盐水溶液，其余各自同样时间点腹腔注射等量生理盐水。

2.3检测指标

2.3.1呼吸频率利用全身体积描记(Whole-body Plethysmography)-呼吸频率监测仪检测呼吸频率，并以此反映肺功能的损伤情况。静息状态和实验结束时进行检测，测量4次取平均值。

2.3.2肺组织病理检测呼吸频率后过量麻醉动物并处死，开胸取右下肺(n=6)，经4%多聚甲醛固定、脱水、包埋、切片、染色、封片等步骤，用普通光学显微镜观察切片。切片由病理医师双盲观测和评分[14]。

2.3.3支气管肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞百分率是急性肺损伤白细胞炎性反应的重要标志。大鼠处死后进行左肺支气管肺泡灌洗(n=6)，以2 mL生理盐水灌洗左肺，反复3次，总回收量约为5 mL。将BALF以300×g速度4 ℃离心，取沉渣涂片，瑞士-吉姆萨染色，光镜下计数细胞总数及中性粒细胞百分率。

2.3.4肺湿/干重比测定生理盐水冲洗右上肺表面血污(n=6)，用滤纸吸干，称湿重，置70 ℃烘箱48 h至恒重后称干重，计算肺湿/干重比，并以此评估肺组织的水肿程度。

2.3.5肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性检测按照试剂盒说明书操作，取右后肺(n=6)制成组织匀浆、离心后取上清加反应液在酶标仪460 nm波长下，测各管OD值。计算公式：MPO单位/克湿片=(测定管OD值-对照管OD值)/(11.3×取样量g)。

2.3.6ROCK2 mRNA表达用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法。用Trizol试剂盒提取肺组织的总RNA，按试剂盒步骤进行第一条链合成和RT-PCR。ROCK2引物为：上游5'CCAGTATAGGCAGTGGACCAG3'，下游5'GGTCGGACATGAAATAGCTTGT3'，产物长度为232bp；GAPDH引物为：上游5'AAGTTCAACGGCACAGTCAAG 3'，下游5'CCAGTAGACTCCACGACATACTCA 3'，产物长度为137bp。取PCR产物加入2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪下进行灰度扫描并观察拍照，分析光密度积分值，结果以ROCK2条带密度与内参照GAPDH条带密度的比值作为mRNA的相对含量。

3　结果

3.1动物一般表现除对照组外，内毒素“二次打击”后其余各组表现出不同程度的竖毛、反应性下降、进行性呼吸困难、气促和发绀等表现，表明已成功造成内毒素血症急性肺损伤模型。

3.2川芎嗪对内毒素血症急性肺损伤的保护作用呼吸频率相对值的变化(实验末期呼吸频率/实验前静息呼吸频率)作为肺功能损伤的整体表现(图2A)，在单纯内毒素“二次打击”组明显上升(与对照组比较，P<0.01)，在应用川芎嗪的2组显著下降(与模型组比较，P<0.01)。

图2　(A)TMP对呼吸频率的影响；(B)TMP对肺损伤积分的影响

注：G1(生理盐水对照组)，G2(内毒素“二次打击”组)，G3(低剂量TMP组)和G4(高剂量TMP组)。与G1比较，#P<0.01；与G2比较，*P<0.01

此外，通过组织学评估内毒素血症急性肺损伤程度。内毒素引起明显中性粒细胞浸润、肺泡间质增厚(间质水肿)和肺泡损伤，而川芎嗪能够大幅度改善这些损伤性变化(图3)。同时，对肺损伤严重程度进行评分结果显示，川芎嗪能够显著降低肺损伤评分(图2B)(与对照组比较，P<0.01；与模型组比较，P<0.01)。

图3　TMP对组织学变化的影响(400×)

注：A(生理盐水对照组)，B(内毒素“二次打击”组)，C(低剂量TMP组)和D(高剂量TMP组)

进而，通过肺湿/干重比和支气管肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞百分率评估肺水肿程度。此两项指标在模型组显著上升(图4)(与对照组比较，P<0.01)；而在应用川芎嗪的2组显著下降(与模型组比较，P<0.01)。

图4　(A)TMP对肺湿/干重比的影响；(B)TMP对BALF中PMN百分率的影响

注：G1(生理盐水对照组)，G2(内毒素“二次打击”组)，G3(低剂量TMP组)和G4(高剂量TMP组)。与G1比较，#P<0.01；与G2比较，*P<0.01

3.3川芎嗪降低急性肺损伤MPO活性MPO活性检测可反映中性粒细胞浸润情况，与正常组比较，内毒素“二次打击”后MPO活性显著升高(图5A)(P<0.01)，川芎嗪能够显著降低MPO活性(P<0.05，G3 vs.G2；P<0.01，G4 vs.G2)。

图5　(A)TMP对MPO活性的影响；(B)TMP对ROCK2 mRNA表达量的影响

注：G1(生理盐水对照组)，G2(内毒素“二次打击”组)，G3(低剂量TMP组)和G4(高剂量TMP组)。与G1比较，#P<0.01；与G2比较，*P<0.01，**P<0.05

3.4川芎嗪下调ROCK2 mRNA表达水平RT-PCR结果显示(图5B)，内毒素“二次打击”组大鼠肺组织ROCK2 mRNA表达水平较对照组均显著升高(P<0.01)；而在应用川芎嗪的2组其表达水平显著下降(与模型组比较，P<0.01)。

4　讨论

内毒素血症时肺血管内皮屏障通透性的升高，是中性粒细胞外渗至血管外组织、触发肺损伤炎症级联反应的关键环节。基于络病学理论，参照最新《脓毒症中西医结合诊疗指南》，该《指南》指出：脓毒症的基本病机是正虚毒损、瘀滞络脉、气机逆乱，脏腑功能失调(图6)。因此，“瘀滞络脉”是内毒素血症乃至脓毒症的重要病位特征[15-16]。既往及前期研究都提示，络脉受损、内皮通透性升高，可归因于Rho/ROCK信号转导途径介导的血管内皮细胞骨架重构，但具体机制未明。本实验中内毒素血症急性肺损伤组在功能学、形态学改变以及肺泡中性粒细胞浸润的同时，MPO活性、ROCK2 mRNA表达水平也明显高于对照组，提示Rho/ROCK信号转导通路参与了“瘀滞络脉”骨架重构的病理过程。

依据脉络学说“营卫承制调平”的核心理论[8]、针对其病机，确立脓毒症的主要治则[15]：扶正排毒通络、分层扭转，而通络以制其“络道亢变”、顾护和修复人体的排毒管道、调其气机逆乱、改善各脏腑的温煦濡养，应贯穿脓毒症治疗的全程。

图6　内毒素血症的“瘀滞络脉”病机假说

近期研究提示，中药单体川芎嗪可能通过减轻机体过度炎性反应、改善器官组织微循环等作用，阻止脓毒症的加剧[2-3,17]，并且不良反应较少。川芎(Ligusticum Chuanxiong Hort.)是历史悠久的传统活血化瘀中药，具有活血行气、祛风止痛功效。川芎嗪是其有效成分之一，属酰胺类生物碱，为四甲基吡嗪。本研究显示，川芎嗪对内毒素血症急性肺损伤的具有保护作用；同时，川芎嗪2组MPO活性、ROCK2 mRNA表达水平均显著低于内毒素血症急性肺损伤组，提示川芎嗪保护内毒素血症急性肺损伤的分子机制可能与抑制RhoA/ROCK信号转导通路进而改善“瘀滞络脉”骨架重构有关。以上基本进展有助于深入探讨内毒素血症骨架重构及其防治机制，并将进一步丰富和完善内毒素血症“瘀滞络脉”理论。

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(2015-07-23收稿责任编辑：张文婷)

A Modified Lipolysaccharide “Two-hit” Induced Acute Lung Injury Model in Rats via Rho/ROCK Mechanism and Protective Effects of Tetramethylpyrazine on Injury Based on Collateral Disease Theory

Li Yan1, Liang Junqing2, Zhang Gaofeng1, Li Jia1, Yang Xilan1, Chen Qianfen1, Zhao Shidi1

(1 Department of Pathophysiology, Bengbu Medical College, Bengbu, Anhui Province 233030, China; 2 Hebei Yiling Medicalresearchinstituteco.,LTD,Shijiazhuang,HeibeiProvince050035,China)

Objective:To investigate the protective effect of tetramethylpyrazine (TMP) on acute lung injury (ALI) in endotoxemia rats with “Collaterals Damaged by Toxic Stasis” (YuZhiLuoMai) and its mechanism of Rho/ROCK. Methods:Endotoxemia rats model in ALI with YuZhiLuoMai were established through lipolysaccharide “two-hit”. Rats were randomized into 4 groups: G1 (normal control group), G2 (“two-hit” group), G3 (low dosage TMP group) and G4 (high dosage TMP group). Measure the respiratory rate, lung wet/dry weight ratio, BALF PMN percentage, pulmonary MPO activity, ROCK2 mRNA expression quantity, observe and evaluate the severity of lung tissue injury. Results:Compared with the G2 rats, TMP significantly reduced respiratory rate, PMN percentage and lung wet/dry weight ratio, MPO activity and ROCK mRNA expression quantity, and reduced the pathological changes in endotoxemia rats with ALI.Conclusion:We found TMP might have better protection against ALI in endotoxemia rats with YuZhiLuoMai through inhibiting RhoA/ROCK pathway.

Collateral Disease Theory; Endotoxemia; Acute lung injury (ALI); Tetramethylpyrazine (TMP); Rho/ROCK

国家自然科学基金项目(编号：81202833)；安徽省自然科学基金项目(编号：1308085MH140)

李言(1977—)，男，安徽，博士，副教授，研究方向：中西医结合防治血管内皮细胞损伤相关疾病，E-mail：408829061@qq.com

赵士弟(1976—)，男，安徽，副教授，研究方向：心脑血管病理生理学，E-mail：zhsdi@126.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.033