EYFP基因导入大豆根瘤菌工程菌株的构建

张先成，甄涛，于盛竹，曲娟娟，于德水

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010；2.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030）

EYFP基因导入大豆根瘤菌工程菌株的构建

张先成1，甄涛1，于盛竹2，曲娟娟2，于德水1

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010；2.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨150030）

将黄色荧光蛋白基因（EYFP）整合到质粒pBBR1MCS-2上，构建pBBR1MCS-2-EYFP，通过三亲本杂交的方法，将构建的载体转化到HW-05中，获得含有黄色荧光蛋白的根瘤菌菌株。

荧光蛋白基因；大豆根瘤菌；三亲本杂交

20世纪以来，分子生物学技术高速发展，随着标记基因的出现，通过基因标记评价根瘤菌的竞争结瘤能力更为快捷和准确。目前，广泛应用的标记基因有发光酶基因、红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因。黄色荧光蛋白基因（Enhanced Yellow Fluorescent Protein gene，EYFP）是GFP增强型荧光基因，广泛应用于动植物和微生物的标记研究。通过本项研究，将荧光蛋白基因导入与我省主栽大豆品种匹配度较高的，为深入研究根瘤菌在土壤和作物根部定殖研究以及根瘤菌的固氮机制做了铺垫性预研工作，为更加充分揭示根瘤菌固氮机理研究做了基础性工作。

1　材料与方法

1.1供试菌株和质粒

慢生型大豆根瘤菌HW-05（Bradyrhizobium japonicum）为本研究室分离并保存的慢生型大豆根瘤菌。大肠杆菌（E.coli）DH5α为本实验室保存。质粒pBBR1MCS-2（KmR）和pRK2013（KmR）均由西班牙塞维利亚大学生物系Jose教授惠赠。

1.2PCR扩增引物

表1　引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3各种酶制剂及试剂盒

实验中所使用的各种限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、T4DNA连接酶等购自Promega、TaKaRa、NEB等生物工程公司；PlasmidminiKit（50）购自OMEGA公司；DNA Purification Kit（50）购自OMEGA公司。

1.4培养基

LB培养基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1 000mL。

TY培养基：酵母粉3g，胰蛋白胨5g，CaCl20.87g，琼脂20g，蒸馏水1 000mL。

2　试验方法

2.1EYFP基因的克隆

利用EYFP基因和pBBR1MCS-2载体共有的HindⅢ和BamHⅠ两种内切酶进行酶切，回收EYFP产物与pBBR1MCS-2进行连接并转化至E.coli DH5α。送予上海生物工程有限公司进行测序。

2.2HW-05重组子的筛选与鉴定

以构建的突变株菌液为模板，分别以EYFP（F）和EYFP（R）为引物，验证HW-05重组子染色体上是否外源基因EYFP。

3　结果与分析

3.1重组载体pBBR1MCS-2-EYFP的构建结果

利用EYFP基因和pBBR1MCS-2载体共有的HindⅢ和BamHⅠ两种内切酶进行酶切，酶切后连接，结果如图1所示，出现一条特异性条带，其大小约为5.9kb左右，再经酶切验证后可以初步确定EYFP基因已经正确的插入到pBBR1MCS-2载体上。

图1　EYFP与pBBR1MCS-2转化后提取结果M：DNAMarker DL10000 1:EYFP/pBBR1MCS-2连接后转化提取结果Fig.1 The resultof EYFP/pBBR1MCS-2 transform ationM:DNAMarker DL10000 1:EYFP/pBBR1MCS-2 extraction result

3.2基因工程菌株的构建结果

利用PCR扩增EYFP基因，结果如图2所示，条带一条特异性条带，其大小约为700bp左右，说明EYFP基因存在于基因组之中。

图2　重组子筛选M：DNAMarker DL100001:HW-05中EYFP基因PCR扩增产物Fig.2 Screen the candidate M:DNAMarker DL100001-:PCR am plication resulto f EYFP gene in HW-05

4　结语

我省是全球野生大豆资源丰富的地区，土壤中存在大量的土著根瘤菌群，其竞争结瘤能力强但固氮能力弱，接种根瘤菌会影响结瘤率，接种效果十分不理想，进而制约了根瘤菌菌剂在我省的推广应用。筛选高效结瘤能力的根瘤菌迫在眉睫，经过我所多年研究，分离获得的根瘤菌HW-05与我省主栽大豆品种具有极强的亲和关系，具备发展为优良根瘤菌菌剂的潜质。随着研究的不断深入，科学地准确评价根瘤菌结瘤竞争能力又是根瘤菌制剂应用于实际的技术关键。

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Construction of EYFP gene into engineered strain of Rhizobium

ZHANG Xian-cheng1，ZHEN Tao1，YU Sheng-zhu2，QU Juan-juan2，YUDe-shui1
（1.Istitute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010 China；2.School of Resourcesand Environment，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Integrating theyellow fluorescentprotein（EYFP）intoplasmid pBBR1MCS-2 to constructpBBR1MCS-2-EYFP，and through themethod of tri-parentalhybridization，the constructed carrierwas transformed into HW-05，so as to obtain Rhizobium strains containinga yellow fluorescent protein.

Fluorescent protein gene；Soybean Rhizobium；Triparental hybridization

S144.5

A

1674-8646（2016）18-0008-02

2016-08-08

于德水（1969-），男，黑龙江哈尔滨人，研究员，从事大豆根瘤菌研究。