miR-206对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及其机制

周　静　张保朝

(南阳市中心医院脑血管介入科，河南　南阳　473000)



miR-206对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及其机制

周静张保朝1

(南阳市中心医院脑血管介入科，河南南阳473000)

目的探讨 miR-206 对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法通过实时定量 RT-PCR检测胶质瘤组织、正常成人脑组织、胶质瘤细胞系U87和U251以及正常人脑胶质细胞(HEB)中miR-206的表达情况。通过脂质体转染构建miR-206稳定过表达细胞系U87和U251，体外实验研究 miR-206对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。通过miRNA靶基因预测数据库预测miR-206的靶基因，并利用荧光素酶报告基因实验检测miR-206对14-3-3ζ的靶向作用。结果miR-206在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中具有较高的表达率。体外实验显示，miR-206抑制胶质瘤细胞的增殖，促进凋亡。靶基因预测分析14-3-3ζ为miR-206潜在的靶基因，荧光素酶实验进一步证实14-3-3ζ是miR-206的直接靶点。结论miR-206可能通过靶向14-3-3ζ抑制胶质瘤细胞增殖，促进凋亡，可能是胶质瘤治疗的新靶点。

miR-206；胶质瘤；增殖；凋亡

miRNAs与肿瘤发生有关〔1〕。胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，具有发病率高、复发率大、死亡率高等特点〔2〕。Zhang等〔3〕报道了抑制miR-221/222基因簇的表达，能够降低胶质瘤细胞的生长速度。miR-21、miR-125b、miR-181a和miR-181b等也被报道能够影响胶质瘤细胞的增殖和凋亡〔1，4〕。miR-206作为新发现的 miRNA 在多种肿瘤中发挥重要的调节作用〔5〕。但是miR-206对胶质瘤细胞的影响尚未报道。本研究拟分析miR-206对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1临床资料2015年1～6月在我院肿瘤科确诊为胶质瘤并且进行手术治疗的患者15例，术前均未进行放化疗。所有组织离体后直接投入液氮中贮存备用。患者年龄60～80岁，平均65.2岁。样品的采集均经患者以及家属的知情同意。

1.2细胞系、载体及试剂人胶质母细胞瘤U87和U251细胞系以及正常人脑胶质细胞(HEB)均从中国科学院上海细胞生物学研究购得。青霉素、链霉素(Sigma公司，美国)，RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS，Gibco BRL公司，美国)，pGL3质粒(Promega 公司，美国)，Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司，美国)，miR-206模拟物及对照购自西安沃尔森生物技术有限公司；PrimeScript RT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ和Lipofectamine 2000转染试剂盒均购自美国GeneCopoeia公司；Ki67、Bcl-2、Caspase-3、p-caspase-3、14-3-3ζ和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体，以及辣根过氧化物酶标记二抗均购自英国Abcam公司；Gene TailorTMSite-Directed Mutagenesis System试剂盒(Invitrogen公司，美国)Dual-Luciferase Reporter System(Biovision公司，美国)。

1.3方法

1.3.1细胞培养将U87和U251胶质瘤细胞株置于含10%的胎牛血清、链霉素 100 μg/ml、青霉素100 U/ml的RPMI1640 培养液中37℃，5% CO2饱和湿度贴壁培养。单层细胞生长达到70%～80% 融合时，进行胰蛋白酶消化，然后以600 r/min 5 min离心传代后继续培养。取对数期活力良好的细胞进行实验。

1.3.2RT-PCR检测严格按照Trizol使用说明书提取组织和细胞中的总RNA，并用紫外分光光度法进行定量。接着按照PrimeScript RT Reagent Kit使用说明，合成miR-206的cDNA，反应条件是95℃，3 min (1个循环)，95℃、12 s，61℃、40 s(38个循环)。实施定量PCR的反应按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ使用说明，反应程序为95℃、10 min预期变性，95℃、10 s，59℃、30 s(40个循环) 。以U6 为内参基因，分析miR-206在不同组织和细胞中的相对表达水平。

1.3.3细胞转染选取对数期生长状态良好的U87和U251细胞，以2×105/孔的密度分别接种于6孔培养板中，孔中均加入不含抗生素的培养液。培养24 h，细胞融合度达到30%～50%。然后按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染，将miR-206模拟物对照(miR-control)和miR-206模拟物(miR-206 mimics)转染至U87和U251细胞内，培养24 h后更换新鲜的培养液。

1.3.4噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖取生长良好的U87和U251转染miR-206模拟物的实验组及对照组细胞，以3×104/孔的密度接种于96孔板后加入DMEM培养基。培养周期4 d，每天按时检测，检测时，每孔先加入20 μl (5 g/L)的MTT溶液，继续孵育4 h，然后换液，每孔加入150 μl二甲亚砜，放入摇床中轻微振荡直至完全溶解MTT转化生成的紫色甲臜。之后用酶标仪检测各孔在570 nm处的吸光度。

1.3.5流式细胞仪检测细胞凋亡取生长良好的U87和U251转染miR-206模拟物和模拟物对照的细胞用于实验。实验严格按照Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，将细胞加入100 μl 1倍上样缓冲液重悬，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)染料，避光，振荡混匀，室温反应10 min。再次加入400 μl 1倍上样缓冲液，混匀。然后用流式细胞仪检测，统计发生早期凋亡的细胞数目。

1.3.6免疫印迹提取各细胞样本的总蛋白，定量，使用10%的分离胶电泳。冰浴下100 V转膜2 h。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相对应的一抗4℃孵育过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗涤3次，10 min/次。加入二抗，37℃孵育1 h，TBST洗涤3 次，15 min/次，在暗室中进行压片，然后显影、定影。

1.3.7miR-206靶基因预测MICROCOSM，TargetScan和PicTar 3个miRNA靶基因预测数据库对miR-206的靶基因进行预测。

1.3.8荧光素酶实验将14-3-3ζ 3′UTR的PCR扩增产物连接到pGL3质粒Xbal酶切位点，构建pGL3-WT-14-3-3ζ(野生型)报告基因质粒。通过GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System 试剂盒，突变14-3-3ζ 3′UTR 序列内的结合位点，构建pGL3-MUT-14-3-3ζ真核表达载体(突变型)。取U251细胞分别转染为以下几组，①14-3-3ζ 野生型质粒：对照组(转染野生型14-3-3ζ质粒和miR-206模拟物对照)、实验组(转染野生型14-3-3ζ质粒和miR-206模拟物)。②14-3-3ζ突变型质粒：对照组(转染突变型14-3-3ζ质粒与miR-206模拟物对照)、实验组(转染突变型14-3-3ζ质粒与miR-206模拟物)。细胞转染24 h后，采用Dual-Luciferase Reporter System，检测荧光素酶活性。

1.4统计学方法采用GraphPad Prism 5软件进行t检验。

2　结　果

2.1miR-206在胶质瘤组织和细胞中低表达RT-PCR结果显示，miR-206在胶质瘤组织中的表达水平(0.38±0.05)显著低于正常人脑组织(设为1)(P<0.05)。在人胶质母细胞瘤U87和U251细胞系中的表达水平(0.40±0.04，0.48±0.06)也显著低于HEB(P<0.05)。

2.2外源性增加miR-206抑制胶质瘤细胞增殖转染miR-206的U87和U251细胞的增殖速度明显低于对照组(P<0.05)。转染miR-206的U87和U251细胞中Ki67蛋白的表达水平(0.42±0.05、0.33±0.04)显著低于对照组(设为1)(P<0.05)。见图1。

图1　U87和U251中miR-206上调对细胞增殖的影响

2.3外源性增加miR-206促进胶质瘤细胞凋亡转染miR-206的U87和U251细胞的凋亡率〔(21.32±2.15)%,(16.58±2.64)%〕明显高于对照组〔(2.87±0.89)%,(3.27±1.08)%〕(P<0.05)，表明外源性增miR-206促进胶质瘤细胞凋亡。转染miR-206的U87和U251细胞中Bcl-2蛋白的表达水平(0.28±0.04,0.33±0.05)相比于对照组(设为1)明显降低，Caspase-3的表达水平(0.92±0.08,1.05±0.09)没有明显变化，而p-Caspase-3的表达水平(2.15±0.25,19.8±0.21)则出现了显著的升高，这也表明了外源性增加miR-206促进胶质瘤细胞凋亡。见图2。

图2　U87和U251中miR-206上调对细胞凋亡的影响

图3　miR-206直接靶向14-3-3ζ

2.4miR-206直接作用于14-3-3ζ将MICROCOSM、TargetScan和PicTar 3个miRNA靶基因预测数据库所得到的预测结果比对之后，选取被三者都预测得到的靶基因作为备选，进而选得14-3-3ζ为靶基因。14-3-3ζ mRNA的3′UTR与miR-206的种子区存在理论上的互补匹配序列，见图3。如图3所示，荧光素酶实验显示共转染14-3-3ζ野生型的实验组中，荧光素酶活性(0.46±0.06)与对照组(设为1)相比明显下降(P<0.05)；而共转染MET突变型的实验组(0.95±0.09)与对照组(1.05±0.08)的荧光素酶活性无显著差异，荧光素酶实验证实miR-206可以直接靶向14-3-3ζ。进一步研究结果显示，转染miR-206的U87和U251细胞中14-3-3ζ蛋白的表达水平(0.42±0.05,0.58±0.08)显著低于对照组(设为1)(P<0.05)。

3　讨　论

胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤，占颅内原发肿瘤的46%，其预后差，即使行联合手术、放化疗等，病人的平均生存期也仅为诊断后的9～12个月〔6〕。胶质瘤的发生、发展是一个复杂的过程。miRNA调控人体60%的蛋白编码基因〔7〕。Xia等〔4〕报道了miR-125通过靶向Bmf影响胶质瘤细胞的增殖和凋亡。Shi等〔1〕报道了hsa-miR-181a和hsa-mir-181b能够抑制胶质瘤的发生。Zhang等〔3〕证实了抑制miR-221/222基因簇的表达，降低了胶质瘤细胞的生长速度。miR-206已经被报道与肿瘤的发生有关〔5〕。Wang等〔8〕报到了miR-206能够调节神经细胞的增殖和凋亡。但是关于miR-206对胶质瘤的发生、发展是否有影响，目前尚未有报道。本研究发现miR-206在胶质瘤组织和人胶质母细胞瘤U87和U251细胞系中有一个较高的表达水平。体外研究也发现外源性增加miR-206抑制胶质瘤细胞增殖、促进凋亡。

14-3-3ζ蛋白在多种癌症中过表达，包括脑肿瘤，被普遍认为是癌症发生的一个致癌基因〔9～11〕。14-3-3ζ存在于多种组织、器官中，例如肾上腺、肠、肝等，尤其在脑中的含量较为丰富，主要位于神经源性成分中，与胶质瘤的发生、发展以及预后都有一定的关系〔12〕。本研究推测miR-206可能通过靶向14-3-3ζ抑制胶质瘤细胞的增殖，促进凋亡。

胶质瘤的发生是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程。miR-206的功能分析显示其能够抑制胶质瘤细胞的增殖，促进凋亡，而且能够直接靶向与胶质瘤发生、发展以及预后都有一定关系的14-3-3ζ蛋白。这为以后深入研究miR-206-14-3-3ζ对胶质瘤生物学特性的影响奠定了理论基础，同时也为今后研究胶质瘤的诊断、治疗以及预后提供了新靶点。

1Shi L，Cheng Z，Zhang J，etal.hsa-mir-181a and hsa-mir-181b function as tumor suppressors in human glioma cells〔J〕.Brain Res,2008；1236(2)：185-93.

2Hwang JH，Smith CA，Salhia B，etal.The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells〔J〕.Neoplasia,2008；10(2)：149-59.

3Zhang C，Kang C，You Y，etal.Co-suppression of miR-221/222 cluster suppresses human glioma cell growth by targeting p27kip1 in vitro and in vivo〔J〕.Int J Oncol,2009；34(6)：1653-60.

4Xia HF，He TZ，Liu CM，etal.MiR-125b expression affects the proliferation and apoptosis of human glioma cells by targeting Bmf〔J〕.Cell Physiol Biochem，2009；23(4-6)：347-58.

5Zhang L，Xia L，Zhao L，etal.Activation of PAX3-MET pathways due to miR-206 loss promotes gastric cancer metastasis〔J〕.Carcinogenesis,2015;36(3):390-9.

6赵学英.RNAi沉默Livin基因对裸鼠移植瘤生长及Ki67蛋白表达的影响〔J〕.临床和实验医学杂志,2015；14(5)：352-5.

7叶振南，徐善水.miRNA 在胶质瘤组织和细胞中的表达及作用〔J〕.山东医药，2013；53(33)：100-2.

8Wang R，Hu Y，Song G，etal.MiR-206 regulates neural cells proliferation and apoptosis via Otx2〔J〕.Cell Physiol Biochem,2012；29(3-4)：381-90.

9Friedman RC，Farh KK，Burge CB，etal.Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs〔J〕.Genome Res,2009；19(1)：92-105.

10Ralhan R，Masui O，DeSouza LV，etal.Identification of proteins secreted by head and neck cancer cell lines using LC-MS/MS：strategy for discovery of candidate serological biomarkers〔J〕.Proteomics,2011；11(12)：2363-76.

11Ko BS，Lai IR，Chang TC，etal.Involvement of 14-3-3γ overexpression in extrahepatic metastasis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Hum Pathol,2011；42(1)：129-35.

12Yan Y，Xu Y，Gao YY，etal.Implication of 14-3-3ε and 14-3-3θ/τ in proteasome inhibition-induced apoptosis of glioma cells〔J〕.Cancer Sci,2013；104(1)：55-61.

〔2016-03-24修回〕

(编辑袁左鸣)

河南省科技厅科技攻关项目(No.112102310173)

张保朝(1963-)，男，硕士生导师，主任医师，主要从事神经内科疾病研究。

周静(1979-)，女，硕士，主治医师，主要从事胶质瘤的研究。

R739.41

A

1005-9202(2016)15-3739-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.060

1南阳市中心医院神经内科