脂联素对帕金森病模型大鼠免疫炎症及氧化应激的保护作用

胡　霞　陈方方　孔陈苏

(新疆医科大学第五附属医院神经内科，新疆　乌鲁木齐　830011)



脂联素对帕金森病模型大鼠免疫炎症及氧化应激的保护作用

胡霞陈方方孔陈苏1

(新疆医科大学第五附属医院神经内科，新疆乌鲁木齐830011)

目的探讨脂联素(APN)对帕金森病(PD)模型大鼠免疫炎症及自由基损伤的保护作用。 方法采用6-羟多巴胺单侧损毁左侧纹状体建立PD大鼠模型，选取40只造模成功的大鼠随机分为模型组和APN组各20只，APN组分别于第1、8、15天经鞘内注射人工合成的APN 60 μg/kg，模型组仅接受鞘内注射人工脑脊液。另取20只正常大鼠(仅行纹状体定位而不注射6-羟多巴胺)作对照。分别于治疗前及治疗1、2、3 w后进行旋转行为学及自主活性观察，检测各组治疗3 w后损毁侧纹状体的炎性因子〔肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和IL-6〕、氧化应激相关指标〔丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)〕及神经递质〔多巴胺(DA)、二羟基苯乙酸 (DOPAC)和高香草酸 (HVA)〕水平，免疫组化法检测损毁侧纹状体的酪氨酸羟化酶 (TH)水平。结果与对照组相比，模型组治疗前后的旋转圈数均升高，自主活动次数降低(P<0.05)；模型组和APN组治疗前旋转圈数和自主活动次数无显著差异，但APN组治疗后的旋转圈数和自主活动次数均优于模型组(P<0.05)，且APN组各时间点旋转圈数和自主活动次数均有显著差异(P<0.05)。与对照组相比，模型组的炎性因子及MDA含量升高，SOD、GSH-Px和CAT活性、神经递质水平及TH阳性细胞数均降低(P<0.05)；APN处理后可改善PD大鼠的以上异常指标(P<0.05)，与对照组的仍有统计学差异(P<0.05)。结论APN对PD大鼠纹状体免疫炎症及自由基损伤具有保护作用，可能与改善损毁侧纹状体的神经递质水平有关。

脂联素；帕金森病；免疫炎症；自由基损伤；神经递质

新近研究发现炎症反应在帕金森病(PD)疾病进展中可能发挥重要作用〔1〕。此外，PD黑质内可见内源性氧自由基堆积，不仅加重了脑组织损伤，同时在一定程度上加速了黑质多巴胺神经受损，继而导致进行性退变〔2〕。脂联素(APN)是一种由脂肪组织分泌的活性物质，除调节糖脂代谢外还具有多种生物活性〔3～5〕。此外，李芹等〔6〕发现APN具有神经保护作用，可改善大鼠脑缺氧灌注损伤。APN能否改善PD大鼠的症状、免疫炎症及氧化应激反应，目前尚未见报道，本研究拟探讨APN处理对PD大鼠损毁侧纹状体免疫炎症及氧化应激的影响。

1　材料与方法

1.1主要试剂及仪器重组球形APN购自瑞士Enzo Life Sciences公司，肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-1β的酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒购自美国RD公司，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自南京建成生物工程公司，过氧化氢酶(CAT)试剂盒购自碧云天生物科技公司，酪氨酸羟化酶(TH)抗体购自美国Santa Cruz公司；仪器：小动物脑立体定位仪及套管针(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)和5430R型冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2动物与分组选取体重为200～220 g的成年雄性SD大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，采用6-羟多巴胺单侧损毁左侧纹状体建立PD大鼠模型，选取40只造模成功的大鼠随机分为模型组和APN组各20只，APN组分别于第1、8、15天鞘内注射人工合成的APN 60 μg/kg，模型组仅接受鞘内注射人工脑脊液。另取20只正常大鼠(仅行纹状体定位而不注射6-羟多巴胺单)作对照。本实验中所用大鼠饲养于SPF级环境下，可自由摄食、饮水，温度控制(22±1)℃，相对湿度为50%～10%，明暗交替 12 h/12 h。

1.3PD模型大鼠的建立采用戊巴比妥钠麻醉后，将大鼠头部固定在立体定位以上，正中切口切开颅顶皮肤，暴露前囟后，以前囟为准，参照Paxinos和Watson鼠脑立体定位图谱进行纹状体立体，具体坐标：前囟前1.0 mm，正中线左侧3.0 mm，硬膜下4.0/5.0 mm。两点分别注射2.5 μl和3 μl的6-羟多巴胺(3.6 mg/ml)，每次注射后留针5 min，缓慢将微量注射器拔出。造模后21 d腹腔注射5 ml/kg阿朴吗啡以诱发旋转行为，以30 min内转速>210 r为造模成功。

1.4旋转行为学观察每组各选取8只大鼠，分别于治疗前及治疗1、2、3 w后进行旋转行为学观察，采用腹腔注射阿朴吗啡以诱发旋转行为，每次观察时间为30 min，连续观察2～3次，最终结果取30 min内转圈数的均值。

1.5自主活动观察每组各选取8只大鼠，分别于治疗前及治疗1、2、3 w后将其放入自主活动箱内，采用自动记录仪记录大鼠的自主活动次数，最终结果表示为10 min内的活动次数。

1.6纹状体的炎性因子及活性物质检测每组取8只大鼠，于治疗3 w后采用颈椎脱臼法处死，将损毁侧纹状体取出，经液氮处理后充分研磨，高速离心后采用BCA法检测上清液蛋白水平，采用相关试剂盒检测损毁侧纹状体的TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平及SOD、GSH-Px和CAT活性。最终结果表示为每mg单位蛋白对应的各指标水平。

1.7神经递质检测将1.6制备的损毁侧纹状体匀浆液，经超声破碎后离心，采用0.22 μm滤膜过滤后，取50 μl待测，采用1200型高效液相色谱仪检测多巴胺(DA)、二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)水平。

1.8免疫组化于末次行为学观察结束后，每组取6只大鼠，颈椎脱臼法处死后取脑组织，经修剪后，低温下冰冻切片机行冠状切片，片厚10 μm，隔5张取1只，依次经抗原修复、封闭、加TH一抗、二抗、辣根酶标记、显色、复染、脱水及二甲苯透明后，在高倍显微镜下观察TH的阳性表达情况，计算每个组织的TH阳性表达率，操作步骤完全遵循免疫组化试剂盒说明书。

1.9统计学处理采用SPSS19.0软件行t检验、单因素分析。

2　结　果

2.1APN对PD大鼠旋转行为学的影响与对照组(设为0)相比，模型组治疗前后的旋转圈数均升高(P<0.05)；模型组和APN组治疗前旋转圈数无统计学差异(P>0.05)，APN组治疗后均少于模型组(P<0.05)，且随着治疗时间的延长而逐渐降低(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠治疗前后的旋转圈数比较

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2APN对PD大鼠自主活动的影响与对照组相比，模型组治疗前后的自主活动次数均降低(P<0.05)，主要表现活动明显减少、肢体震颤、反应震颤、偏斜、弓背、后肢骚扰、躁动及激惹等异常行为；模型组和APN组治疗前自主活动次数无统计学差异(P>0.05)，APN组治疗后均多于模型组(P<0.05)，且随着治疗时间的延长而逐渐升高(P<0.05)。见表2。

表2　各组大鼠治疗前后的自主活动次数比较,次/10 min,n=8)

2.3APN对PD大鼠损毁侧纹状体炎性因子含量的影响与对照组相比，模型组损毁侧纹状体的TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高(P<0.05)；APN组含量低于模型组，但高于对照组(P<0.05)。见表3。

2.4APN对PD大鼠损毁侧纹状体神经递质水平的影响与对照组相比，模型组损毁侧纹状体的DA、DOPAC和HVA水平均降低(P<0.05)；APN组均高于模型组，且对照组比较差异显著(P<0.05)。见表4。

表3　各组大鼠损毁侧纹状体的炎性因子含量比较

表4　各组大鼠的损毁侧纹状体神经递质水平比较

2.5APN对PD大鼠损毁侧纹状体氧化应激相关指标的影响与对照组相比，模型组损毁侧纹状体的MDA水平升高，但SOD、GSH-Px和CAT活性均降低(P<0.05)；APN组MDA水平低于模型组，SOD、GSH-Px和CAT活性均高于模型组(P<0.05)，且与对照组比较差异显著(P<0.05)。见表5。

表5　各组大鼠的损毁侧纹状体的氧化应激相关指标比较±s,n=8)

2.6APN对PD大鼠损毁侧纹状体TH表达的影响对照组、模型组和APN组的损毁侧纹状体TH阳性表达率依次为(56.21±12.78)%、(16.74±3.29)%和(38.44±6.11)%，三组差异显著(P<0.05)。

3　讨　论

PD是一种常见的老年神经系统退行性疾病，主要表现为静止性震颤、僵直及姿势障碍等，DA的主要病因为中脑黑质多巴胺能神经元丧失和纹状体的DA浓度降低，故多巴替代疗法是PD的首选方法，但随着治疗时间的延长，药效减弱直至完全失效〔1〕，故除补充多巴类制剂外，还应联合其他有效的手段，以缓解PD进展。目前研究认为，氧化应激及炎性反应均参与了PD的发病过程。多项研究表明缓解炎症反应及改善氧化应激均可有效缓解PD症状并延缓进展〔7～9〕，而APN有确切的抗感染、抗氧化作用。本研究采用经典的纹状体注射6-羟多巴胺的方法制备PD模型〔10,11〕，结果显示APN可改善PD大鼠的症状，且APN对PD进展有较好的延缓效果。

PD发生发展中的氧化应激主要与氧自由基清除系统缺陷有关，造成纹状体中大量的氧自由基堆积，不仅会通过氧化生物膜上的不饱和脂肪酸造成重要细胞器结构和功能损伤，而且会生成大量的过氧化物来损伤脑组织〔10〕。氧化应激主要表现为氧化物增多及氧化物酶活性降低。本研究表明PD大鼠出现了内源性的氧自由基堆积，与相关研究的结果一致〔2,7〕。另外APN治疗可能需要更大的剂量或联合其他手段才能发挥更好的效果。Fang等〔11〕发现APN可通过AMPK和cAMP来缓解血管紧张素诱导的肾小管细胞氧化应激，本研究推测APN也可能通过AMPK和cAMP途径来发挥对PD氧化应激的改善作用。

炎症介导的神经毒性是PD发病及进展的重要因素，而炎症因子可通过级联反应来诱导神经细胞死亡，故缓解炎症反应对于PD的治疗有重要意义〔12〕。前炎症细胞因子在维持神经系统上发挥重要作用，当神经系统受到损伤性刺激或小胶质细胞活化时，会释放大量的前炎症细胞因子，来损害黑质DA神经元功能，最终参与了PD的病变过程〔13〕。本研究表明APN可降低PD大鼠的炎症反应，继而起到对黑质纹状体DA神经元的保护作用。

神经递质在维持神经元功能上发挥了重要作用〔14〕。本研究提示APN对PD大鼠纹状体免疫炎症及自由基损伤具有保护作用，可能与改善损毁侧纹状体的神经递质水平有关，在PD防治中有较好的价值。

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3Iannitti T,Graham A,Dolan S.Adiponectin-mediated analgesia and anti-inflammatory effects in rat〔J〕.PLoS One,2015;10(9):e0136819.

4Marique L,Senou M,Craps J,etal.Oxidative stress and upregulation of antioxidant proteins,including adiponectin,in extraocular muscular cells,orbital adipocytes,and thyrocytes in Graves' disease associated with Orbitopathy〔J〕.Thyroid,2015;25(9):1033-42.

5Zhi Z,Pengfei Z,Xiaoyi T,etal.Adiponectin ameliorates angiotensin II-induced vascular endothelial damage〔J〕.Cell Stress Chaperones,2014;19(5):705-13.

6李芹,刘煜敏,周绍霞,等.脂联素对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用〔J〕.中华神经科杂志,2013;46(11):755-9.

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11Fang F,Liu GC,Kim C,etal.Adiponectin attenuates angiotensin II-induced oxidative stress in renal tubular cells through AMPK and cAMP-Epac signal transduction pathways〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2013;304(11):1366-74.

12Herrero MT,Estrada C,Maatouk L,etal.Inflammation in Parkinson's disease:role of glucocorticoids〔J〕.Front Neuroanat,2015;9:32.

13Tian Y,Zhang Y,Zhang R,etal.Resolvin D2 recovers neural injury by suppressing inflammatory mediators expression in lipopolysaccharide-induced Parkinson's disease rat model〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2015;460(3):799-805.

〔2015-12-11修回〕

(编辑滕欣航)

孔陈苏(1973-)，女，副主任医师，主要从事运动障碍性疾病、神经系统变性病研究。

胡霞(1974-)，女，副主任医师，硕士，主要从事运动障碍性疾病、神经系统变性病研究。

R749

A

1005-9202(2016)15-3662-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.023

1新疆鄯善县人民医院