牡荆素-4′-O-葡萄糖苷在大鼠体内的首关效应研究Δ

吴成举，柴纪严，张文洁（.辽宁中医药大学教学实验中心，沈阳 003；.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 60）

牡荆素-4′-O-葡萄糖苷在大鼠体内的首关效应研究Δ

吴成举1＊，柴纪严1，张文洁2（1.辽宁中医药大学教学实验中心，沈阳 110032；2.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116011）

目的：研究牡荆素-4′-O-葡萄糖苷（VG）在大鼠体内的首关效应及其机制，为其新药剂型研究提供依据。方法：10只SD大鼠分为肝门静脉给药组和股静脉给药组，分别于肠系膜上静脉iv VG、股静脉灌注VG，通过测定VG在肝脏的AUC计算代谢率；15只SD大鼠分为胃灌注组、肠灌注组和肝门静脉给药组，分别于胃底、十二指肠灌注VG及肠系膜上静脉iv VG，通过测定VG在胃、肠的AUC计算代谢率；15只SD大鼠分为肠灌注组、股静脉给药组和生理盐水组，在给药前10 min，前2组大鼠灌注细胞色素P450（CYP）3A与P糖蛋白（P-gp）的底物维拉帕米注射液（60 ml/kg），生理盐水组大鼠灌注等体积生理盐水，之后按照上述方法给药，考察维拉帕米对VG肠吸收的影响。结果：VG在肝脏、胃、肠道的代谢率分别为54.9%、1.7%、91.9%；灌注维拉帕米后，肠灌注组大鼠VG的AUC表现出轻微的增加趋势。结论：肝、肠首关作用是导致VG生物利用度低的主要因素，初步判断VG是肠道CYP 3A和/或P-gp的底物。

牡荆素-4′-O-葡萄糖苷；首关效应；代谢率；CYP3A；P-糖蛋白；大鼠

山楂叶［1-3］为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶，收载于2015年版《中国药典》（一部）中［4］，具有活血化瘀、理气通脉之功效，用于改善气滞血瘀［5-6］、胸闷憋气、心悸健忘［7-9］、眩晕耳鸣等症状［10］。牡荆素-4′-O-葡萄糖苷（VG）是山楂叶中黄酮类的主要活性成分［11］，但文献报道其生物利用度低［12］。因此，在本研究中笔者复制了大鼠肝脏和胃、肠道首关效应模型并进行相关研究，以解释其口服生物利用度偏低的原因。此外，肠道内细胞色素P450（CYP）3A的代谢作用和P糖蛋白（P-gp）的外排作用也是影响药物吸收的主要因素之一［13］，且已有文献报道黄酮类化合物中的某些成分是CYP3A和P-gp的底物。因此，在本研究中笔者选择了这2种蛋白酶的共同底物，同时也是诱导剂的维拉帕米［14］，通过观察VG是否与维拉帕米产生竞争性抑制作用［15］，确定VG是否是肠道CYP 3A和/或P-gp的底物，为其新剂型的开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

1100型高效液相色谱（HPLC）仪，包括G1310A四元泵、G1312A真空脱气机、G1314A紫外-可见分光光度计（美国安捷伦公司）；HH-S水浴锅（上海永光明仪器设备厂）；XYJ80-2型离心机（金坛市金南仪器厂）；TGL-16C型高速台式离心机（江西医疗器械厂）；XW-80A型微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；ZDHW型电子调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）；动物手术器械、红外灯、微量取样器（上海荣泰生化工程有限公司）。

1.2 药物与试剂

VG对照品（辽宁中医药大学实验中心实验室自制，批号：20150207，纯度：＞98%）；橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110721-200613，纯度：＞98%）；甲醇、乙腈（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；冰醋酸、乌拉坦均为分析纯；纯化水（娃哈哈有限公司）；盐酸维拉帕米注射液（天津市中央药业有限公司，批号：H12020051，规格：5 mg∶2 ml）。

1.3 动物

清洁级SD大鼠64只，♂，体质量（250～320）g，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXX（辽）2008-0002。实验期间大鼠自由饮水，给药前禁食不禁水12 h。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品贮备液的制备 精密称取VG对照品（批号：20150207）10 mg，置于10 ml量瓶中，用5 ml甲醇超声（功率：180 W，下同）溶解10 min后稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为1 000 μg/ml的对照品贮备液，于4 ℃冰箱保存，备用。

2.1.2 内标贮备液的制备 精密称取橙皮苷3.30 mg，置于10 ml量瓶中，用5 ml甲醇超声溶解10 min后稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为330 μg/ml的内标贮备液，于4 ℃冰箱保存，备用。

2.1.3 空白生物样品的制备 随机取SD大鼠24只，分成4组，每组6只，分别用于在股静脉、肝门静脉、胃、肠道部位的空白生物样品制备。实验前12 h禁食不禁水，ip 20%乌拉坦麻醉，行颈动脉插管术，采集动脉血液，离心（3 000 r/min，离心半径3.3 cm）15 min，收集血浆，将6只大鼠的血浆混合，于－20℃冰箱保存，备用。

2.1.4 质控（QC）样品的制备 精密吸取100 μl空白血浆，加入一定浓度的对照品溶液50 μl，按照“2.1.3”项下方法制备质量浓度分别为1.25、10、80 μg/m（l低、中、高质量浓度）的QC样品，于4 ℃冰箱保存，备用。

2.1.5 生物样品的预处理 分别取大鼠血浆100 μl，置于2 ml具塞离心试管中，依次加入内标贮备液30 μl、乙酸10 μl、甲醇0.5 ml，涡旋混合1 min，按“2.1.3”项下方法离心15 min，取上清液，于50 ℃氮气流下吹干，残渣加入流动相100 μl复溶，涡旋溶解1 min，离心（10 000 r/min，离心半径3.3 cm）10 min，取上清液20 μl，即得。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C1（8150 mm×4.6 mm，5 μm）；预柱：Kromasil C1（835 mm×8.0 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-四氢呋喃-1%冰醋酸水溶液（6∶2∶18∶74，V/V/V/V）；检测波长：330 nm；流速：1 ml/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μl；内标：橙皮苷。在上述色谱条件下，取“2.1.1”～“2.1.3”项下各溶液进样测定，结果理论板数以VG计不少于3 000，分离度＞2.0，各成分达到基线分离。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 High performance liquid chromatogram

2.3 线性关系考察

精密吸“2.1.3”项下空白血浆100 μl共7份，依次加入不同质量浓度VG（1、2、4、10、20、40、100 μg/ml）贮备液50 μl、内标贮备液30 μl，配制成血浆质量浓度为0.5、1、2、5、10、20、50 μg/ ml的生物样品。按“2.1.5”项下方法处理生物样品，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以VG质量浓度（x，μg/ ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得股静脉、肝门静脉样本回归方程均为y=0.160 5x+0.001 9（r=0.999

6），VG质量浓度线性范围为0.5～50 μg/ml；胃、肠部位样本回归方程均为y=0.168 8x－0.035 1（r=0.999 7），VG质量浓度线性范围为0.2～20 μg/ml。

2.4 检测限（LOD）和定量限（LOQ）试验

将已知质量浓度的对照品贮备液无限稀释，精密吸取50 μl至100 μl的空白血浆中，按“2.1.5”项下方法处理样品，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，结果，VG的检测限（信噪比为3）为0.18 μg/ml、定量限（信噪比为10）为0.06 μg/ml。

2.5 精密度试验

取低、中、高质量浓度QC样品，各6份，连续测定3 d，以当日的标准曲线计算QC样品的浓度，考察方法精密度。结果，日内精密度RSD在6.77%～9.04%之间（n=6），日间精密度RSD在2.90%～6.66%之间（n=6）。

2.6 提取回收率试验

取100 μl空白血浆18份，除不加系列对照品溶液和内标贮备液外，按“2.1.5”项下方法操作，吸取上清液后加入系列对照品溶液50 μl和内标贮备液30 μl，涡旋混合，50 ℃氮气流下吹干。残留物以100 μl流动相溶解，按“2.1.3”项下方法离心10 min，取上清液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。设定该处理方法得到数据的提取回收率为100%。另取低、中、高质量浓度的QC样本，各5份，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并与上述设定的提取回收率进行比较。结果显示，VG的提取回收率为89.2%～99.0%，RSD均小于15%（n=5）。

2.7 VG在大鼠体内的首关效应研究

2.7.1 VG在肝脏的代谢率 10只SD大鼠随机分为肝门静脉给药组和股静脉给药组，每组5只。各组大鼠ip 20%乌拉坦0.3 ml/kg。待大鼠轻微麻醉后，将其固定在手术台上，行颈动脉插管术，管内充满含80 u/ml肝素的生理盐水以防止血液凝固。肝门静脉给药组大鼠插管后立即剖开腹腔，开口约2 cm，找到肠系膜上静脉，通过肠系膜上静脉iv VG 10 mg/kg，给药时间为5 min。随后立即行腹腔缝合手术，并在给药后0、3、5、10、15、20、30、50、80、120、180、240、330 min于颈动脉采血适量。按“2.1.3”项下方法离心15 min，收集血浆，于－20 ℃冰箱中保存，待测。在整个实验过程中，大鼠始终于红外灯照射下维持正常体温，以确保实验的正常进行。在进行肝门静脉给药的同时，设计平行实验以减少实验误差，故同时在股静脉iv等体积生理盐水。股静脉给药组大鼠行动脉插管后，将大鼠一侧腿部皮肤打开，找到股静脉后灌注VG 10 mg/kg，给药时间5 min，随后立即缝合，采血时间和平行实验设计同肝门静脉给药组大鼠。通过测定VG在肝脏的AUC和生物利用度（%），计算代谢率（%）=1－生物利用度。

各组大鼠于给药后5 min出现了血浆药物浓度的最高峰；于给药后20 min出现了双峰现象。VG在肝脏的血药浓度-时间曲线见图2，药动学参数见表1。

结果，肝门静脉给药后，VG在血浆中的生物利用度为45.1%，即肝脏对VG的代谢率为54.9%。

2.7.2 VG在胃、肠道的代谢率 15只SD大鼠随机分为胃灌注组、肠灌注组和肝门静脉给药组，每组5只，麻醉及插管方法同“2.7.1”项下方法。胃灌注组大鼠插管后剖开腹腔，开口约为2 cm，找到胃后从胃底部灌注VG 20 mg/kg，灌注时间为5 min，随后行腹部缝合术；肠灌注组大鼠插管后剖开腹腔，开口约为2 cm，找到十二指肠后从距离幽门端1 cm的位置灌注VG 20 mg/kg，灌注时间为5 min，随后行腹部缝合术；肝静脉给药组大鼠处理方法同“2.7.1”项下方法。各组采血时间和平行实验设计同“2.7.1”项下方法。测定VG在胃、肠道的AUC和生物利用度，计算代谢率。

图2 VG在肝脏的血药浓度-时间曲线Fig 2 Blood-time curve of VG concentration in liver

表1 VG在肝脏的药动学参数Tab 1 Pharmacokinetic parameters of VG in liver

VG在胃、肠道的血药浓度-时间曲线见图3，药动学参数见表2。

图3 VG在胃、肠道的血药浓度-时间曲线Fig 3 Blood-time curve of VG concentration in stomach and intestine

表2 VG在胃、肠道的药动学参数Tab 2 Pharmacokinetic parameters of VG in the stomach and intestine

结果，与肝门静脉灌注组比较，胃、肠道灌注组大鼠的生物利用度分别为98.3%、8.1%，代谢率分别为1.7%、91.9%。

2.7.3 CYP 3A与P-gp对VG肠吸收的影响 15只SD大鼠随机分为肠灌注组、股静脉给药组和生理盐水组，每组5只。肠灌注组和生理盐水组大鼠于肠灌注VG前10 min先分别灌注盐酸维拉帕米注射液（60 ml/kg）与等体积生理盐水后，按“2.7.2”项下方法处理；股静脉给药组大鼠于灌注VG前10 min先灌注盐酸维拉帕米注射液（60 ml/kg）后，按“2.7.1”项下方法处理。各组采血时间和平行实验设计同“2.7.1”项下方法。考察维拉帕米对VG药动学的影响。

各组大鼠加用盐酸维拉帕米后VG的血药浓度-时间曲线见图4。

图4 各组大鼠灌注盐酸维拉帕米后VG的血药浓度-时间曲线Fig 4 Blood-time curves of VG of the groups after infusionof verapamil

结合图2与图4可知，维拉帕米对股静脉给药组大鼠的VG药动学几乎不产生影响；与生理盐水组比较，肠灌注组大鼠VG的AUC表现出轻微的增加趋势，同时双峰现象的程度有所增加。

3 讨论

本研究探讨VG在大鼠肝门静脉、十二指肠以及胃中的代谢率，其给药剂量依据预实验得出，即大鼠肝门静脉给药剂量为10 mg/kg、十二指肠为20 mg/kg、胃为20 mg/kg。为研究肠道内CYP3A与P-gp对VG肠吸收的影响，根据动物与人临床用药换算原则，在VG给药前先给予盐酸维拉帕米注射液60 mg/kg。

本研究结果显示，肝脏、肠道、胃对VG的代谢率分别为54.9%、91.9%、1.7%，即肝首关作用和肠首关作用是导致VG生物利用度低的主要原因。另一方面，与生理盐水组比较，肠灌注组大鼠体内VG的AUC表现出轻微的增加趋势，同时双峰现象的程度有所增加，说明在一定程度上维拉帕米对VG起到了竞争性抑制的作用，据此初步判断VG是肠道CYP3A和/ 或P-pg的底物。因此，在临床应用中，可以考虑通过联合用药的方法增加VG的吸收率，以解决其口服生物利用度低的问题。

此外，本研究建立的HPLC法具有专属性，经证实可用于大鼠血浆中VG含量的测定。综上所述，肝首关作用和肠首关作用是导致VG生物利用度低的主要因素，初步判断VG是肠道CYP 3A和/或P-gp的底物。本研究结果可为后续新药剂型的开发与利用提供一定的参考。

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Study on the First-Pass Effects of Vitexin-4′-O-Glucoside in Rats in vivo

WU Chengju1，CHAI Jiyan1，ZHANG Wenjie2（1.Teaching and Experiment Center，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning Dalian 116011，China）

OBJECTIVE：To investigate the first-pass effect and mechanism of vitexin-4′-O-glucoside（VG）in rats so as to provide a basis for new drug development.METHODS：10 SD rats were divided into a group of hepatic portal venous administration and a group of femoral venous administration，which respectively received VG iv at superior mesenteric vein and femoral vein，and then metabolic rate was calculated by finding out the AUC of VG in the rats’livers.15 SD rats were divided into a group of gastric infusion，a group of intestinal infusion and a group of hepatic portal venous infusion，which respectively received VG by infusion at gastric fundus and duodenum and iv at superior mesenteric vein，and then metabolic rate was calculated by finding out the AUC of VG in the rats’stomachs and intestines.15 SD rats were divided into a group of intestinal infusion，a group of femoral venous administration and a group of normal saline.At 10 min before administration，the former two groups were given by infusion verapamil injection（60 ml/kg），the substrate of CYP3A and P-glycoprotein（P-gp）；and the group of normal saline were given by infusion of isometric normal saline，and then the rats were given VG as above to observe the effect of verapamil on intestinal absorption of VG.RESULTS：The metabolic rates of VG in the liver，stomach and intestine were 54.9%，1.7%and 91.9%respectively.After infusion of verapamil，slight increase in AUC of VG was found in the rats in the group of intestinal infusion.CONCLUSIONS：The first-pass effects in the liver and intestine are the main factors related to the low bioavailability of VG.Based on preliminary judgment，VG is the substrate of intestinal CYP3A and/or P-gp.

Vitexin-4′-O-glucoside；The first-pass effect；Metabolic rate；CYP3A；P-glycoprotein；Rats

R969.1

A

1001-0408（2016）25-3491-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.11

2016-04-08

2016-07-18）（编辑：刘明伟）

沈阳市科技计划项目（No.F13-194-9-00）

＊高级实验师。研究方向：生理药理与实验针灸。电话：024-31207016。E-mail：1935116200@qq.com