雪莲菌发酵乳对慢性肝损伤大鼠肝功能的影响

刘　馨　孔　渊　牛　惠　申道福

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁　锦州　121001)



雪莲菌发酵乳对慢性肝损伤大鼠肝功能的影响

刘馨孔渊牛惠申道福

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121001)

目的探讨雪莲菌发酵乳对四氯化碳(CCl4)导致的慢性肝损伤大鼠肝功能的影响。方法采用CCl4制备大鼠慢性肝损伤模型，设正常组、模型组、雪莲菌发酵乳组和联苯双酯组(阳性对照)。测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量，同时观察肝组织病理变化。结果模型组大鼠有明显肝损伤表现，各给药组肝损伤均有不同程度的改善(P<0.01 或P<0.05)。病理组织学检查结果表明，给药组肝脏病变程度均较模型组明显减轻。结论雪莲菌发酵乳可以缓解CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤。

雪莲菌；慢性肝损伤

雪莲菌，又称西藏灵菇、藏灵菇，外形酷似米粒，是一种乳白色、胶质状的块状物的野生菌，由微生物产生的胞外多糖与乳蛋白聚合而成〔1,2〕。雪莲菌是一种天然形成的混菌发酵系统，是由多种微生物组成的微生态共生体系，其中包含乳酸菌和酵母菌及少量的醋酸菌〔3，4〕。Maeda等〔5〕发现雪莲菌对自发性高血压易卒中型大鼠具有降血脂降血压的效应，Diniz等〔6〕研究认为雪莲菌具有抗炎作用，Vinderola等〔7〕发现雪莲菌具有调节免疫的功能，Silva等〔8〕发现雪莲菌的杀菌作用，Gao等〔9〕又发现雪莲菌发酵乳的cell-free fraction部分具有抑制胃癌细胞株SGC7901增殖的效应。本研究拟分析雪莲菌发酵乳对四氯化碳(CCl4)导致慢性肝损伤大鼠的肝功能影响。

1　材料与方法

1.1材料雪莲菌：西藏林芝生态绿色农业合作社生产；联苯双酯滴丸： 北京协和药厂；CCl4：天津市光复科技发展有限公司；鲁花牌花生油：山东鲁花集团有限公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(AIB)测定试剂盒均为长春汇力生物技术有限公司产品；健康 SD 雄性大鼠 40 只，体重(200±20)g，购自辽宁医学院实验动物中心，合格证号：LY20141122。

1.2造模所有动物自由进食和饮水，在适宜的温度和湿度下饲养，光照周期 12 h/12 h；适应性饲养1 w。按照随机分配原则，选取10只大鼠作为正常组，其余的 30 只大鼠进行慢性肝损伤造模。根据文献记载〔10〕，给予需要造模的大鼠腹腔注射 50% CCl4/花生油溶液 0.15 mg/100 g ，每周注射两次共注射8 w，建立大鼠慢性肝损伤模型。参照Rizk等〔11〕的方法制备雪莲菌发酵乳，雪莲菌粒培养于灭菌脱脂乳中，接种量5 g/100 ml，置于28℃条件下恒温培养，每24 h更换一次灭菌脱脂乳，连续培养3 d。取第3天的发酵乳，滤去雪莲菌粒，得到雪莲菌发酵乳，-20℃保存备用。

1.3分组给药将造模成功后的30只大鼠随机分为模型组、雪莲菌发酵乳组和联苯双酯(阳性对照)组，每组10只。正常组和模型组大鼠给予同等剂量生理盐水灌胃，雪莲菌发酵乳组大鼠给予1 ml/100 g剂量的雪莲菌发酵乳灌胃，联苯双酯组灌胃 0.1 g/kg联苯双酯，1次/d，连续8 w。8 w后应用 0.6%戊巴比妥钠麻醉大鼠，采集下腔静脉血 3 ml，3 000 r/min离心10 min，留取血清，采用全自动生化分析仪测定 ALT、AST、ALP、TP、ALB水平。剪取大鼠肝左叶相同部位肝组织，置于 4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，制备4 μm切片，HE 染色，在光学显微镜下观察肝组织的损伤情况。

1.4统计学分析采用SPSS19.0软件，两组组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。

2　结　果

2.1动物的一般状态正常组：大鼠毛有光泽，活动自如，饮食及大小便正常；模型组：随着造模时间延长活动逐渐减少， 动物普遍出现食欲差，鼠毛稀疏， 皮毛粗糙无光泽，精神较萎靡，饮食量减少。在整个造模过程中体重增加缓慢，特别是在造模后期体重基本不增加甚至减轻；雪莲菌发酵乳组：大鼠毛光泽，活动、饮食及大、小便均较模型组有所改善，给药期间动物体重有所增加；联苯双酯组：大鼠一般情况改善效果较雪莲菌发酵乳组更明显。

2.2各组大鼠血清中 ALT、AST、ALP 活性情况与正常组相比，模型组大鼠血清ALT、AST、ALP均明显升高，雪莲菌发酵乳组及联苯双酯组大鼠血清ALT、AST、ALP水平有所降低，其中以联苯双酯组更明显(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠血清ALT、AST、ALP活性比较

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.3各组大鼠血清中 TP、ALB水平变化变化与正常组相比，模型组大鼠血清TP和ALB水平均明显升高，给药后与模型组大鼠相比，雪莲菌发酵乳组及联苯双酯组大鼠血清TP升高；联苯双酯组大鼠的ALB水平较模型组有所回升(P<0.05)。见表2。

表2　各组大鼠血清 TP、ALB比较

图1　各组大鼠肝脏病理改变(HE)

2.4雪莲菌发酵乳对CCl4致慢性肝损伤大鼠肝脏病理损伤的影响图1可见，正常组大鼠肝小叶结构完整，无细胞变性坏死，无炎性细胞浸润也无胶原沉积模型组大鼠肝小叶结构破坏，细胞变性严重，有明显的脂肪变，炎性细胞浸润及胶原增生严重。雪莲菌发酵乳组大鼠肝小叶结构破坏减轻，肝内亚假小叶结构有所减少，细胞变性较少，炎性细胞浸润较少，胶原增生较轻。联苯双酯组大鼠肝小叶结构破坏明显减轻，细胞变性现象较少见。

3　讨　论

慢性肝损伤是机体在应对各种生物或者非生物损伤的过程中，致病因子刺激过程中所致肝实质细胞和非实质细胞受损。若致病因子长时间存在，会导致肝细胞变性、坏死，甚至肝组织内胶原沉积，导致肝纤维化，最终可以导致肝功能障碍，甚至肝衰竭〔10,12〕。CCl4进入大鼠肝脏，激活肝脏细胞色素 P450，继而生成 CCl3，其可攻击肝细胞内质网膜上的磷脂分子，引起细胞膜的脂质过氧化，导致膜结构和功能完整性的破坏〔13,14〕。随着中毒次数与时间的增加和延长，慢性肝损伤及其早期肝纤维化就会越来越明显。

CCl4所致大鼠慢性肝损伤的重要指标是血清 ALT、AST、ALP 酶活性明显升高，ALB、TP含量明显降低和肝脏病理学的变化。雪莲菌包含由多种微生物组成的微生态群落，具有抗炎、杀菌、降血脂、降血压、增强免疫力、防止癌细胞扩散等作用。Huseini等〔15〕发现雪莲菌发酵乳(国外称为开菲尔)是一种治疗严重烧伤的有效药物，其效果和传统磺胺嘧啶银盐治疗疗效相当。本研究发现，经雪莲菌发酵乳干预后，肝损伤模型大鼠血清中 ALT、AST、ALP活性均有所降低，ALB、TP 含量有所升高，肝组织病理明显改善；虽没有联苯双酯改善效果明显，但已表明雪莲菌发酵乳对CCl4所致动物慢性肝损伤具有一定的保肝降酶作用。

1周龙霞,郑学云,薛锋,等.天山雪莲菌酸奶中菌株的分离及生理生化鉴定〔J〕.安徽农业科学,2013；41(18):7963.

2Zhou JZ,Liu XL,Huang KH,etal.Application of the mixture design to design the formulation of Pure cultures in Tibetan kefir〔J〕.Agric Sci Chin,2007;6(11):1383-9.

3高洁.雪莲菌菌相分析及抗癌活性研究〔D〕.杭州：浙江大学,2013.

4Chen ZN,Shi JL,Yang XJ,etal.Chemical and physical characteristics and antioxidant activities of the exopolysaccharide produced by Tibetan kefir grains during milk fermentation 〔J〕.Int Dairy J,2015;43(1):15-21.

5Maeda H,Zhu X,Omura,K,etal.Effects of an exo-polysaccharide (kefir grain)on lipids,blood pressure,blood glucose,and constipation 〔J〕.Biofactors,2004;22(1-4):197-200.

6Diniz RO,Garla LK,Schneedorf JM,etal.Study of anti-inflammatory activity of Tibetan mushroom,a symbiotic culture of bacteria and fungi encapsulated into a polysaccharide matrix〔J〕.Pharmacol Res,2003;47(1):49-52.

7Vinderola CG,Duarte J,Thangavel D,etal.Immunomodulating capacity of kefir 〔J〕.J Dairy Res,2005;72(2):195-202.

8Silva KR,Rodrigues SA,Xavier L,etal.Antimicrobial activity of brothfermented with kefir grains 〔J〕.Appl Biochem Biotechnol,2009;152:316-25.

9Gao J,Gu F,Hui R,etal.Induction of apoptosis of gastric cancer cells SGC7901 in vitro by a cell-free fraction of Tibetan kefir 〔J〕.Int Dairy J,2013;30(1):14-8.

10张海燕,温韬,卢静,等.四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤模型方法的探讨〔J〕.实用肝脏病杂志,2009；12(3):161-3.

11Rizk S,Maalouf K,Baydoun E.The antiproliferative effect of kefir cell-free fraction on HuT-102 malignant T lymphocytes 〔J〕.Clin Lymphoma Myeloma,2009;9(Suppl 3):S198-203.

12何云,王宇明.银杏内酯防治四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的作用观察〔J〕.实用肝脏病杂志,2009；12(1):8-10.

13马骏,徐颖,黄正明,等.苯丙氨酸二肽类化合物190对小鼠CCl4肝损伤的保护作用〔J〕.解放军药学学报,2009；25(5):383-6.

14程丽娟,陈晓农,刘青川,等.灵五颗粒对四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤的影响〔J〕.医药导报,2011；30(7):865-9.

15Huseini HF,Rahimzadeh G,Fazeli MR,etal.Evaluation of wound healing activities of kefir products 〔J〕.Burns,2012;38(5):719-23.

〔2015-11-27修回〕

(编辑郭菁/徐杰)

辽宁省科技厅科技计划项目(2014410004)；辽宁医学院校长基金项目

刘馨(1977-)，男，医学博士，副教授，副主任检验师，硕士生导师，主要从事临床肿瘤标记物研究。

R57

A

1005-9202(2016)17-4163-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.012