亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后凋亡相关蛋白表达的影响及保护作用

黄　杰　李丽茹　张　斌

(上海交通大学附属第六人民医院南院，上海　201400)



亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后凋亡相关蛋白表达的影响及保护作用

黄杰李丽茹张斌

(上海交通大学附属第六人民医院南院，上海201400)

目的通过检测丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)及Caspase-9蛋白的表达，探讨亚低温对局灶性脑缺血再灌注(IR)后神经元存活的影响。方法用Longa线拴法制作局灶性脑IR模型，将40只SD大鼠随机分成正常组、假手术组、常温组和亚低温组，常温组和亚低温组均缺血8 h,再灌注4 h、24 h、72 h、1 w(n=4)与相应时间点处死，亚低温组于脑缺血后12～15 min实施病灶侧亚低温持续4 h。免疫组化法检测AKT及Caspase-9蛋白的表达。结果不同缺血再灌注时间点，亚低温组比常温组缺血侧半暗带AKT表达水平显著增高(P<0.05)，Caspase-9显著降低(P<0.05)。结论亚低温通过促进缺血半暗带脑组织AKT表达，抑制Caspase-9表达，从而抑制神经元凋亡，减少神经元损害。

脑缺血;亚低温;凋亡;丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶;Caspase-9

研究表明丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)、磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)参与脑缺血再灌注(IR)后神经元凋亡过程〔1〕，亚低温对于脑缺血的保护作用是多方面的〔2〕，AKT、Caspase-9作为重要的细胞损伤相关因子越来越受到关注。本实验建立大脑中动脉梗死缺血模型观察亚低温对AKT、Caspase-9在脑缺血半暗带区的影响及亚低温的可能机制。

1　材料和方法

1.1动物与分组选择清洁级健康雄性SD大鼠40只，体重180～200 g，鼠龄6～8 w。由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心〔生产许可证号:SCXK(黑)20020002〕提供，标准环境下饲养(常温自由进食饮水)。大鼠随机分为正常组(n=4)，假手术组(n=4)，常温组(n=16)和亚低温组(n=16)，其中常温及亚低温组分别在缺血8 h后再4 h,24 h,72 h和1 w，每个时间点4只。

1.2主要试剂和仪器一抗AKT、Caspase-9购自武汉博士德生物工程有限公司，二抗试剂盒购自北京中杉金桥公司，步骤同说明书。亚低温组采用可调控亚低温仪(哈尔滨工业大学热工教研室研制,专利号ZL98230936.0)。

1.3动物模型制备手术参考改良的Nagasawa等〔3〕方法，制备大鼠左侧大脑中动脉(MCA)缺血再灌注模型，在30 min 内完成模型制作，亚低温组于脑缺血后12～15 min诱导头部亚低温MCA 缺血8 h 后将尼龙线抽出颈内动脉(ICA)即可恢复MCA 血液供应。MCA 闭塞后13～15 min内把脑温诱导至31℃～32℃并持续2～4 h，实验后脱离温度调节，让大鼠自然复苏。MCA 闭塞后6 h 将大鼠处死，进行组织处理和染色。假手术组不将尼龙线插入ICA，其余操作同常温组及亚低温组。

1.4组织标本的制备各组大鼠分别于IR后各时间点经心脏插管,生理盐水冲洗,然后灌注4%甲醛内固定取脑，于视交叉后3 mm 处取3 mm 厚组织，置于4%多聚甲醛液中固定24 h。常规脱水、石蜡包埋，冠状面连续切片，厚度约3 μm，分别行HE 染色、免疫组化染色。

1.5统计学方法采用SPSS13.0软件行方差分析和t检验。

2　结　果

2.1常温组与亚低温组AKT、Caspase-9 阳性细胞数比较见表1，图1。AKT 阳性细胞主要位于缺血半暗带区域。缺血24 h时达高峰，其后下降。亚低温组比常温组AKT阳性细胞数显著增高(P<0.05)。Caspase-9脑缺血再灌注4 h即有表达，主要位于缺血半暗带，脑缺血再灌注24 h达高峰并持续到72 h，之后降低，亚低温与常温组相比，阳性细胞数明显减少(P<0.05)。

表1　亚低温对局IR后AKT、Caspase-9表达影响

常温组AKT(×132)

亚低温组AKT(×200)

常温组Caspase-9(×132)

亚低温组Caspase-9(×132)

2．2各组大鼠脑组织病理学改变假手术组与正常组大鼠脑组织均未见明显异常。常温组大鼠可见左侧大脑皮质有梗死灶，呈典型的缺血性改变，组织水肿明显，神经元变性、坏死。梗死灶与周围脑组织界限清楚，其中心区神经元数量明显减少。亚低温组脑梗死灶较脑缺血组明显减小，脑组织缺血性改变和脑水肿明显减轻，见图2。

图2　常温及亚低温脑缺血病灶(HE，×200)

3　讨　论

20世纪90年代，临床应用28℃～35℃亚低温治疗重型颅脑损伤和急性脑卒中取得了良好的效果，可能保护机制包括对于亚低温治疗脑梗死的作用机制考虑可能抑制一氧化氮(NO)、白三烯等的生成和释放,减少脑细胞的代谢，降低酸中毒;抑制致炎细胞因子的生成和释放;减少钙离子内流;促进脑细胞结构与功能的修复，抑制坏死和线粒体释放细胞色素C(CytC)诱导神经元凋亡〔4,5〕。目前国内外有关细胞凋亡研究出现的时间说法不一可能与多种因素有关〔6〕。

PI3/AKT是细胞内重要的信号转导分子，活化的AKT通过磷酸化作用进一步激活或抑制其下游靶蛋白，进而发挥调节细胞的增殖、分化等作用。AKT，是PI3K直接的下游作用靶点，具有抗凋亡作用，其抗凋亡作用一方面可通过磷酸化并激活下游的凋亡调控蛋白，如Caspase-9、NF-κB等，调节抗凋亡基因的转录。对PI3K/Akt途径的调控可以降低损伤及IR引起的脑损伤，AKT在脑缺血后对于缺血区神经元具有保护作用，起保护作用是多方面的，可能通过众多的信号通路来完成其抗凋亡作用〔7,8〕。本研究提示亚低温可抑制脑缺血后细胞凋亡，减轻缺血性脑水肿、脑损害，明显缩小脑梗死体积，具有脑保护作用。

本实验发现AKT、Caspase-9表达阳性细胞多位于缺血半暗带区，参与缺血后神经细胞凋亡，亚低温治疗可使AKT的表达上调，Caspase-9的表达下调，提示亚低温治疗可能抑制或延缓了细胞凋亡，说明亚低温对于脑缺血具有护作用。

综上所述，本研究推测亚低温可能通过AKT信号途径抑制细胞凋亡，对脑IR后的损伤起到保护作用。

1Wang HY，Wang GL，Yu YH，etal． The role of phosphoinositide-3-kinase/Akt pathway in propofol-induced postconditioning against focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Brain Res，2009；1297:177-84．

2Roberto Alexandre Dezena,Benedicto Oscar Colli,Carlos Gilberto Carlotti Junior,etal.Pre,intra and post-ischemic hypothermic neuroprotection in temporary focal cerebral ischemia in rats:morphometric analysis〔J〕.Arq Neuropsiquiatr，2012;70(8):609-16.

3Nagasawa H，Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic hanges in a new rat model of middle cerebral artery occlusion〔J〕.Stroke，1989;20(8):1037-43.

4宋祖军，马俊清，余厚友,等.亚低温对大鼠急性脊髓损伤后炎性细胞因子表达的影响〔J〕.中国急救医学杂志，2009;29(2)：137-9.

5Wang JK，Yu LN，Zhang FJ，etal.Post conditioning with sevoflurane protects against focal cerebral ischemia and reperfusion injury via PI3K/Akt pathway〔J〕.Brain Res，2010;1357:142-51．

6Choi R,Andres RH,Steinberg GK,etal.Intraoperative hypothermia during vascular neurosurgical procedures〔J〕.Neurosurg Focus,2009;26:E24.

7Luca Filippi,Patrizio Fiorini,Marta Daniotti,etal.Safety and efficacy of topiramate in neonates with hypoxic ischemic encephalopathy treated with hypothermia〔J〕.Neo Nati.BMC Pediat,2012;12:144.

8Yuan Y，Guo Q，Ye Z，etal． Ischemic postconditioning protects brain from ischemia /reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis through PI3K-Akt pathway〔J〕.Brain Res,2011;1367(1):85-93．

〔2014-12-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

上海市卫生局面上项目(No.20124286)；上海市奉贤区科委(No.奉科2010-101101；奉科2013-101102)

李丽茹(1970-)，女，主任医师，副教授，主要从事心脑血管疾病的基础与临床研究。

黄杰(1970-)，男，硕士，副教授，副主任医师，主要从事神经疾病的临床与基础研究。

R743.1

A

1005-9202(2016)17-4153-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.007