pH响应性聚合物胶束的制备、表征及对阿霉素的控制释放研究

苑莹芝,马　敏,张　丹,袁建超

(西北师范大学 化学化工学院，甘肃省高分子材料重点实验室，甘肃 兰州 730070)



pH响应性聚合物胶束的制备、表征及对阿霉素的控制释放研究

苑莹芝,马敏,张丹,袁建超

(西北师范大学 化学化工学院，甘肃省高分子材料重点实验室，甘肃 兰州 730070)

以主链含腙键的聚乙二醇大分子(PEG-NH-N=CH-OH)为引发剂，通过开环聚合己内酯(ε-CL)，制备了一种具有pH响应性的两亲性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL. 运用核磁共振(1H NMR)、透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)等对聚合物的结构、胶束的形貌及粒径进行表征. 结果表明，聚合物胶束呈规整球形且分布均匀，平均粒径约98 nm， pH 5.0时胶束粒径显著增加. 负载阿霉素(DOX)的聚合物胶束的载药量为16.4%，包封率为57.4%. 体外释放研究表明，pH 5.0时药物释放速率比pH 7.4时快，48 h后累计释放率达91.1%. 因此，该pH响应性聚合物胶束作为抗癌药物载体具有潜在的应用价值.

聚合物胶束；两亲性嵌段共聚物；pH响应性；阿霉素；控制释放

恶性肿瘤的发病率大幅增加,严重威胁到人类的生命和健康[1]. 化疗是治疗癌症最有效的手段之一,但抗癌药物的非特异性分布、全身毒性、以及肿瘤细胞的多重耐药性是导致感染药物治疗和肿瘤化疗失败的重要原因,降低了抗癌药物的治疗疗效[2-3]. 其中,抗癌药物阿霉素(DOX)常用于各种癌症的治疗,如卵巢癌,乳腺癌,肺癌和软组织瘤. 但由于DOX的短半衰期和对正常组织的毒副作用,如心脏中毒和骨髓抑制,DOX的临床应用受到极大限制[4-5]. 近年来,生物可降解聚合物胶束作为纳米药物载体备受瞩目[6-8],它能包裹疏水性药物,提高药物在水中的溶解度,延长药物在血液中的循环时间. 另外,聚合物胶束的尺寸一般为10～200 nm,可以避免纳米粒子过早地被肾脏清除和免疫系统吞噬,并且凭借高通透性和滞留效应(EPR效应),促进了大分子类物质在肿瘤组织处的选择性分布,达到被动靶向的作用,降低全身副作用和改善药物利用率[9-10].

值得注意的是,EPR效应只能促进纳米载药体系在肿瘤部位富集,但无法将药物定向输送到肿瘤细胞内并完成快速药物释放,也不能控制药物的释放量为靶向位点提供有效的药物浓度[11]. 刺激响应性胶束可根据内部刺激(如pH、氧化还原电位、溶酶体酶)或外部刺激(如温度、磁场、光)快速响应,如溶解、溶胀或坍塌,从而达到在靶位或在合适时间释放药物的目的,提高治疗疗效[12-14]. 在这些刺激中,pH响应性是使用最广泛的,由于人体环境天然存在pH的差异,如肿瘤组织的pH(pH 6.0～7.2)低于人体血液和正常组织(pH 7.4)而显酸性,肿瘤细胞内的pH更低(早期核内体: pH 5.0～6.0,晚期溶酶体: pH 4.0～5.0)[15-18]. 目前,已有大量基于酸敏感键(原酸酯、腙和缩醛等)的pH响应性胶束的研究. 其中,特别是腙键,它在中性条件下稳定,酸性环境中容易水解，并被广泛用于连接聚合物主链和各种活性治疗药物[19-24]. 聚乙二醇(PEG)和聚(ε-己内酯)(PCL)是具有生物可降解性和良好生物相容性的材料,并已获得FDA批准. 由PEG-PCL嵌段共聚物自组装形成的胶束作为纳米药物载体尤为常见[25-27]. 但其存在降解缓慢和无刺激响应性等缺陷,从而阻碍了药物在肿瘤部位高效累积,降低了体内抗肿瘤效率.

图1　pH响应性胶束的自组装及细胞内DOX释放Fig.1　Illustration of self-assembly pH-sensitive micelles andpH-triggered intracellular release of DOX

本文中我们将腙键引入到两亲性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL的主链上,制备了一种生物相容性好的pH响应性药物载体. 嵌段共聚物在水溶液中自组装形成聚合物胶束,PEG嵌段被赋予优良的生物相容性优先位于外表面,而PCL嵌段位于核心内负载药物. 在溶酶体的酸性环境中,载药胶束迅速膨胀或破裂,药物得以释放并最终渗入细胞核,杀死肿瘤细胞(图1). 利用动态光散射和透射电镜观察聚合物胶束的大小和形貌,并验证了其pH响应性. 同时制备了载有阿霉素的聚合物胶束,并对其体外药物释放进行了研究.

1　实验部分

1.1试剂及仪器

聚乙二醇(PEG,Mn=5 000)、对硝基苯基氯甲酸酯(NPCF)、对羟基苯甲醛 (PHB)、ε-己内酯 (ε-CL)、盐酸阿霉素(DOX·HCl)、吡啶、水合肼、锌酸亚锡 (阿拉试剂公司)；二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) (北京化工厂)；其他为常用分析纯试剂.

Nano-ZS90动态光散射纳米粒度仪(Malvern Ltd,英国); Mercury plus-400 MHz核磁共振波谱仪(Varian,美国); JEM-2100F透射电子显微镜(TEM,JEOL,日本); DUV-3700紫外可见分光光度计(UV/Vis,日本岛津公司).

1.2PEG-NPCF的合成

称取PEG (100 mg, 0.02 mmol) 溶于20 mL CH2Cl2中,用微量进样器向该反应体系中加入16.11 μL吡啶,不断搅拌直至溶解. 将5 mL NPCF (200 mg, 0.99 mmol) 的CH2Cl2溶液逐滴加入到反应体系中,搅拌24 h, 控制整个反应过程的温度为0 ℃. 反应后，浓缩反应液并用石油醚、乙酸乙酯沉淀,重复操作3次后,真空干燥至恒重,即得白色固体PEG-NPCF.

1.3PEG-NH-NH2的合成

称取PEG-NPCF (100 mg, 0.02 mmol)溶于 10 mL 无水乙醇,将29.10 μL水合肼逐滴滴加到反应体系中,90 ℃回流搅拌48 h. 冷却至室温后,浓缩反应液,加入石油醚、乙酸乙酯,使沉淀析出,用无水乙醇洗涤沉淀,重复操作3次后,真空干燥即得淡黄色固体PEG-NH-NH2.

1.4PEG-NH-N=CH-OH的合成

称取PEG-NH-NH2(200 mg, 0.04 mmol),PHB (20 mg, 0.16 mmol) 置于Schlenk瓶中,用4 mL 的DMSO溶解,加入1滴无水乙酸,抽真空充氮气循环3～5次,密封Schlenk瓶,于65 ℃搅拌反应48 h. 用石油醚、乙酸乙酯沉淀,过滤,重复操作3次后,真空干燥即得白色固体.

1.5PEG-NH-N=CH-PCL的合成

在Schlenk瓶中，将PEG-NH-N=CH-OH (100 mg, 0.02 mmol),ε-CL(130 mg, 1.14 mmol),锌酸亚锡 (20.25 mg, 0.05 mmol) 溶于5 mL 甲苯中,抽真空充氮气循环3～5次,于110 ℃搅拌反应24 h. 冷却至室温后,加入适量氯仿使反应物完全溶解,用冷乙醚沉淀,过滤,真空干燥即得淡黄色固体PEG-NH-N=CH-PCL.

1.6聚合物胶束的自组装及表征

将10 mg聚合物加入到1 mL DMF中,超声直至溶解,然后逐滴滴加(1滴 / 15 s)10 mL蒸馏水,室温搅拌24 h后即得稳定的聚合物胶束. 取5 mL胶束溶液转移至透析袋(MWCO 3000)中,用蒸馏水透析48 h,即得空白聚合物胶束. 37 ℃条件下,采用动态光散射(DLS)测量聚合物胶束的粒径及粒径分布. 通过透射电镜(TEM)观察聚合物胶束的形态结构. 将透析得到的聚合物胶束滴在铜网表面,放在红外灯下,待干燥后,采用TEM检测,加速电压为200 kV.

1.7载药胶束的制备与体外释放

将5 mg PEG-NH-N=CH-PCL和2 mg DOX溶于0.5 mL DMF中,超声直至溶解,然后向溶液中逐滴滴加(1滴 / 15 s)5mL磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4),室温下搅拌24 h. 将载药胶束溶液转移至透析袋(MWCO 3 000)中,在磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中透析48 h,在12 000 r/min下离心15 min,冷冻干燥上层清液得到载药胶束,整个过程在避光条件下进行.配制不同浓度的DOX溶液,在37 ℃下,用UV/Vis可见光谱检测480 nm激发波长处的吸光度,绘制标准曲线. 为了测量载药量,将冻干的载药胶束溶于DMF中,检测其在480 nm处的吸光度值,并带入标准曲线方程中,包封率和载药量的计算公式如下:

包封率=(负载到胶束中DOX的质量/

(1)

载药量=(负载到胶束中DOX的质量/

(2)

计算结果,胶束的包封率为57.4% ,载药量为16.4%.

将载药胶束溶于5 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中(1 g/L),置于透析袋(MWCO 3000)后,将其分别放于100 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和pH 5.0的醋酸缓冲溶液中透析.在理想时间间隔(1、3、8 h等)内,每次取3 mL透析液测样,并立即放回以维持培养基的体积.用 UV/Vis可见光谱在480 nm 处检测透析液中DOX的吸光度,并绘制体外释放曲线.

2　结果与讨论

2.1聚合物的核磁共振氢谱表征

PEG通过取代,肼解等一系列反应得到末端为羟基的聚乙二醇大分子,并以此大分子作为引发剂,开环聚合ε-CL,合成两亲性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL. PEG-NH-N=CH-OH和PEG-NH-N=CH-PCL的1H NMR谱图如图2所示.

图2　聚合物PEG-NH-N=CH-OH(A)和PEG-NH-N=CH-PCL(B)的核磁共振谱图Fig.2　1H NMR spectra of PEG-NH-N=CH-OH (A)and PEG-NH-N=CH-PCL (B)

图2A中δ3.22(a)和3.49(b)处分别为PEG-NH-N=CH-OH中甲氧基(-OCH3)和重复单元(-OCH2CH2O-)的质子吸收峰,11.05(c)处为-NH-的质子吸收峰,8.55(d)处为-N=CH-的质子吸收峰,表明成功合成含腙键的聚乙二醇大分子引发剂. 图2B为嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL的1H NMR谱图,δ2.31、1.65、1.38、4.06(f、g、h、i)处分别为PCL的质子吸收峰,峰面积之比为2:4:2:2. 与图2A相比,聚合物PEG-NH-N=CH-PCL中其他质子的位置基本保持不变,说明腙键在聚合的过程中没有被破坏,以上分析证明成功合成了两亲性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL. 根据图2B中PEG在δ3.63(b)处的特征峰积分面积Sb=1可得Si=0.24,因此由下面的公式计算出聚合物中PCL的聚合度(DP)为54, 则PEG-NH-N=CH-PCL的数均相对分子质量Mn=11 324.

(3)

2.2PEG-NH-N=CH-PCL胶束的粒径、形貌及pH响应性

粒径是药物递送的一个关键参数,对体内药代动力学和胶束的分布有显著影响[28]. TEM照片(图3B)表明聚合物胶束为核-壳球形结构,在水中分散性良好,粒径为98 nm 左右. 与DLS测量结果(图3A)相比，数值偏小,这可能是因为TEM测试的是铜网上干燥状态下的聚合物胶束, PEG外壳收缩,粒径变小. 由于在聚合物制备的过程中引入了腙键,在弱酸性条件下,腙键会发生断裂,引起PCL核裂解和PEG外壳脱落. 因此,为了证实这一响应机理,在37 ℃条件下,利用DLS测定胶束在pH 7.4和5.0的缓冲溶液中不同时间间隔内的粒径变化,如图

图3　聚合物胶束的动态光散射图(A)和透射电镜照片(B)Fig.3　Size distribution determined by DLS (A) andTEM micrographs (B) of the polymeric micelles

图4　PEG-NH-N=CH-PCL胶束响应pH的粒径变化图Fig.4　Size change of PEG-NH-N=CH-PCL micellesin response to pH determined by DLS

4所示,结果表明,pH 5.0时,胶束迅速溶胀或聚集,3 h内,胶束粒径从起初的110 nm增加到204 nm,24 h后粒径达到809 nm. 相反,pH 7.4时,24 h 内,胶束粒径几乎没有任何改变.由此证明,聚合物胶束具有明显的pH响应性,同时也表明了制备的胶束具有良好的稳定性.

2.3阿霉素的体外药物释放研究

为了进一步研究载药胶束作为药物载体对DOX的缓释行为,我们分别在pH 7.4 和5.0的缓冲溶液中模拟体外药物释放,释放曲线如图5所示. pH 7.4时,DOX的累积释放率十分缓慢,48 h后累计释放率仅为18.3%. 而pH 5.0时, 起初1 h内DOX的累计释放率为12.5%,出现明显的暴释现象,8 h后累积释放率逐渐变缓,48 h后累计释放率高达91.1%.这一释放结果说明聚合物胶束对pH具有响应性,可以对细胞内酸性环境作出响应,实现细胞内药物的可控释放,同时有利于提高药物在肿瘤细胞中的累积,减少药物毒副作用.

图5　pH 响应性载药胶束的体外药物释放图Fig.5　In vitro release behavior of DOX frompH-sensitive drug-loaded micelles

3　结论

合成了一种简单的基于腙键pH响应的两亲性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL. 该共聚物在水溶液中自组装形成核-壳结构的球形聚合物胶束，胶束分散性良好且稳定存在，粒径在98 nm左右. pH 5.0时,连接PEG和PCL的腙键断裂,导致胶束尺寸变大或解离. 载药胶束的体外模拟释放研究结果表明, pH 5.0时的药物累计释放率明显较高,48 h内DOX的累积释放率达91.1%,而pH 7.4时DOX的累积释放率为18.3%. 总之, PEG-NH-N=CH-PCL胶束为智能药物载体系统提供了一个高效的平台,在癌症治疗中有着极为广阔的应用前景.

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[责任编辑：张普玉]

pH-sensitive polymeric micelles: preparation, characterization and controlled release of DOX

YUAN Yingzhi, MA Min, ZHANG Dan, YUAN Jianchao*

(KeyLaboratoryofGansuPolymerMaterials,CollegeofChemistryandChemicalEngineering,NorthwestNormalUniversity,Lanzhou730070,Gansu,China)

A novel pH-sensitive block copolymer (PEG-NH-N=CH-PCL) containing hydrazone bond was synthesized by ring-opening polymerization ofε-caprolactone (ε-CL) in the presence of PEG macromolecular initiator containing hydrazone bond (PEG-NH-N=CH-OH). The structure of polymer, morphology and particle size of micelles were confirmed by nuclear magnetic resonance (1H NMR), transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS).The results showed that polymeric micelles had regular spherical structure and mean size was about 98 nm, the diameter of the micelles increased significantly in pH 5.0. The drug loading content and loading efficiency of DOX-loaded micelles were 16.4% and 57.4%, respectively. The in vitro release studies suggested that the drug release of micelles in pH 5.0 was much faster than that in pH 7.4. The cumulative release rate was up to 91.1% within 48 h. Thus, the pH-responsive polymer micelles have potential applications as anti-cancer drug carrier.

polymeric micelle； amphiphilic block copolymer； pH-sensitive； doxorubicin； controlled release

2016-07-05.

国家自然科学基金资助项目(21364011， 20964003).

苑莹芝(1990-)，女，硕士生，研究方向为靶向抗肿瘤高分子药物、生物高分子材料等.*

，E-mail: jianchaoyuan@nwnu.edu.cn.

O63；TB381

A

1008-1011(2016)05-0630-06