复发性外阴阴道假丝酵母菌病的菌种及药物敏感度研究

胡红珍　王丽娟　李丽萍　罗丽娅



·临床研究论著·

复发性外阴阴道假丝酵母菌病的菌种及药物敏感度研究

胡红珍王丽娟李丽萍罗丽娅

目的分析复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC)患者阴道分泌物假丝酵母菌菌种和菌株基因型以及其对临床抗真菌药物的敏感度，为临床诊治提供依据。方法选择50例RVVC患者(RVVC组)及50例外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)患者(VVC组)，采集患者的阴道分泌物标本进行菌种鉴定，使用微卫星CAI位点单链构象多态性(CAI-SSCP)及基因扫描相结合的方法对菌种进行基因型鉴定，用纸片法对菌种进行药物敏感度试验。结果2组患者阴道分泌物共培养出155株假丝酵母菌，其中白假丝酵母菌占83.2%，非白假丝酵母菌占16.8%；RVVC组中白假丝酵母菌占78.4%；VVC 组中白假丝酵母菌占92.5%，RVVC组白假丝酵母菌比例低于VVC组(P<0.05)。2组患者阴道分泌物培养的白假丝酵母菌CAI区序列分析中共获得32种CAI基因型，其中CAI 30-45和CAI 32-46为最常见的基因型，2组患者白假丝酵母菌优势基因型菌株比例差异无统计学意义(P>0.05)。RVVC对抗真菌药物的敏感度依次为伊曲康唑(96.2%)、制霉菌素(91.2%)、酮康唑(82.5%)、氟康唑(76.5%)、克霉唑(59.8%)、咪康唑(53.9%)。结论RVVC患者阴道分泌物中假丝酵母菌的菌种分布与VVC患者不一致。RVVC患者阴道来源的白假丝酵母菌基因型呈现优势基因型分布。假丝酵母菌对临床常用抗真菌药物存在一定的耐药性，治疗RVVC应该根据药物敏感度试验结果实施个体化治疗方案。

假丝酵母菌；菌种鉴定；基因型；单链构型多态性；耐药性

Drug resistance

根据流行病学研究数据，全球约75%的已婚妇女一生中至少患有1次外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)，其中约半数患者发作2次或以上，而这些患者中约5%发展成复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC)[1]。RVVC指VVC经过治疗后虽然临床症状和体征消失，且真菌学检查为阴性，但随后症状复发及真菌学检查又呈阳性，1年中反复4次或以上者，该病由于具有反复发作又顽固不愈的特点，成为临床治疗的障碍，是一种严重干扰女性身心健康的常见妇科病[2]。本研究采用微卫星CAI位点单链构象多态性(CAI-SSCP)与基因扫描相结合分别对RVVC和VVC患者阴道来源的酵母菌株进行基因型鉴定，研究菌株基因型和RVVC发病之间的相互关系，并且分析RVVC患者菌株的药敏特点，旨在为临床诊治和合理用药提供直接依据。

对象与方法

一、研究对象

连续纳入2013年6月至2014年12月在深圳福田区妇幼保健院门诊就诊的50例RVVC患者(RVVC组)以及50例VVC患者，患者年龄(32.5±6.5)岁。RVVC指1年中症状发作次数超过4次，就诊时阴道分泌物涂片假丝酵母菌阳性；VVC 组为具有典型的临床症状，且为初发者，近期内未进行任何药物治疗，直接镜检见假菌丝和芽生孢子，培养分离出假丝酵母菌[3]。所有纳入研究的患者在就诊前1个月内均未使用过激素、免疫抑制剂、抗生素，排除伴有导致自身免疫力下降的疾病及糖尿病患者、孕妇、性工作者、吸毒者。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均对研究知情，并同意留取标本。

二、主要试剂及仪器

主要试剂：ROSCO Neo-Sensitab抗真菌药敏纸片(深圳优康生物技术有限公司)，蛋白胨、葡萄糖、丙稀酷胺和巯基乙醇(北京鼎国生物技术有限公司)，甘油、过硫酸铵、乙醇、冰醋酸、甲醛、醋酸钾、氯仿、醋酸钠、异戊醇和异丙醇(北京现代东方精细化学品有限公司)，DNA聚合酶MgCl2缓冲液(上海申能博彩生物技术有限公司)。主要仪器：电子天平(浙江温州医疗器械三厂)，生物安全柜(ESCO公司,美国)，智能生化培养箱(浙江宁波海曙赛福实验仪器厂)，振荡培养箱(SHAKER公司，德国)，离心机(TIACHI公司，日本)，水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)，酸碱度调节仪(HANNA公司，意大利)，PCR仪(Eppendorf公司，德国)，DCodeTM突变检测电泳仪、琼脂糖凝胶成像系统(Bio-Rad公司，美国)，培养皿、试管(北京中创先锋科技有限公司)。

三、研究方法

1. 菌落培养

采集并分离上述2组患者在患病急性期阴道分泌物中的假丝酵母菌。采集方法见文献[2]：用消毒棉签取患者的阴道侧壁分泌物，将分泌物涂片，置于高倍镜下镜检，可观察到菌丝或孢子。将新鲜标本直接接种于添加了氯霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂(YPD)富集液体培养基，培养至液体培养基呈浑浊状态，后将浑浊的菌液均匀涂布于平板培养基，置于37℃、5%CO2培养48 h后取出观察，肉眼可见乳酪样菌落生长，挑取单菌落划线接种于平板培养基，经过3次反复分离和纯化后，最终挑选单个菌落接种于液体培养基进行活化后备用。

2. 菌种鉴定

根据文献[4]报告的方法提取假丝酵母菌的总DNA， PCR扩增内转录间隔1(ITS l)区。根据ITS1区SSCP电泳图谱，将具有代表性的假丝酵母菌株进行D1/D2序列分析，PCR产物由深圳华大基因技术有限公司完成测序，根据Blast对比测序的序列并与EMBL/DDBJ/GenBank基因数据库中已有的各假丝酵母菌原始序列之间的差异，确定菌株种属。

3. 白假丝酵母菌基因型分析

先用DCodeTM突变检测电泳仪进行SSCP电泳检测，然后根据电泳图的结果进行归类，并选出具有代表性泳道所对应的菌株，用6-梭基突光素标记上游引物C1，并加入下游引物C2，以菌株的DNA为扩增模板，PCR法扩增得到相应的序列，行琼脂糖凝胶电泳检测，可见到明亮条带。扩增产物于ABI370DNA测序仪上样电泳，用Genescan3.7软件自动分析扩增片段的大小以及其中重复片段的数目。以标准菌株CC90028的CAI中2个等位基因位点重复片段数(27-38)为标准，确定待测菌株的CAI基因型(具体操作由深圳华大基因技术有限公司完成)[5]。

4. 药物敏感度试验

应用ROSCO Neo-Sensitab抗真菌药敏纸片，对酮康唑、制霉菌素、氟康唑、伊曲康唑、咪康唑和克霉唑等6种药物进行抑菌试验，按厂家说明书步骤操作，根据抑菌圈直径判为敏感、中度敏感和耐药[6]。以ATCC90028白假丝酵母菌为质控菌株。

四、统计学处理

使用SPSS 16.0软件处理和分析数据。计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

一、菌种的分类鉴定

RVVC组和VVC组患者的阴道分泌物均养出假丝酵母菌。标本经过分离、纯化、培养后，共获得155株较固定的单一菌落。对从样本中获得的菌株进行ITS l区PCR扩增，并对扩增的ITS1区序列进行SSCP电泳图分析后，基本确定的菌株种类可分为5种类型，从各类型菌株中再选取2～4株代表菌株进行ITS全段序列的PCR扩增，扩增产物经测序分析，结果共获得5种菌株，包括白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌和季也蒙毕赤假丝酵母菌。155株假丝酵母菌中，白假丝酵母菌129株(83.2%)，非白假丝酵母菌26株(16.8%)。RVVC组102株中，白假丝酵母菌80株(78.4%)，光滑假丝酵母菌20

株(19.6%)，近平滑假丝酵母菌1株(1.0%)和季也蒙毕赤假丝酵母菌1株(1.0%)，见图1。VVC组53株中，白假丝酵母菌49株(92.5%)，光滑假丝酵母菌3株(5.7%)，热带假丝酵母菌1株(1.9%)。RVVC组和患者阴道分泌物中白假丝酵母菌比例差异有统计学意义(χ2=4.912，P=0.027)。

图1　RVVC及VVC患者阴道分泌物培养

泳道1：热带假丝酵母菌；泳道2：近平滑假丝酵母菌；泳道3、4：白假丝酵母菌；泳道5、6：光滑假丝酵母菌；泳道7：季也蒙毕赤假丝酵母菌

二、白假丝酵母菌的基因型鉴定

白假丝酵母菌CAI区SSCP结果见图2A，CAI区基因扫描结果见图2B。147株白假丝酵母菌CAI区分析共获得32种基因型，最常见2种基因型分别为CAI 30-45(50株，占34.0%)和CAI 32-46 (30株，占20.4%)，这2种基因型在CAI片段上仅相差2个三碱基的重复片段，即基因型为30～32和43～47，为优势基因型。VVC组优势基因型所占比例为71.7% (38/53株)，而RVVC组优势基因型菌株所占比例为73.5%(75/102)，2组患者中白假丝酵母菌优势基因型菌株比例差异无统计学意义(χ2=0.059，P=0.808)。

图2　RVVC患者白假丝酵母菌的基因型鉴定结果

A：随机选取的33株RVVC白假丝酵母菌CAI区SSCP结果；B：RVVC白假丝酵母菌CAI区基因扫描结果(右边的序号27-38、30-45、32-46代表基因型)

三、RVVC的抗真菌药物药敏试验结果

RVVC组102株假丝酵母菌对6种抗真菌药物的敏感度试验中，敏感度由高至低依次为伊曲康唑(96.2%)、制霉菌素(91.2%)、酮康唑(82.5%)、氟康唑(76.5%)、克霉唑(59.8%)、咪康唑(53.9%)，见图3。

图3　RVVC患者白假丝酵母菌的抗真菌药物敏感度试验结果

讨　　论

RVVC的发病机制与多种因素有关，但其病因可归因于两方面因素，即宿主和致病菌。对于引起RVVC反复发作的致病菌源尚有争议，主要是假丝酵母菌不仅在生殖系统，而且在人体其他多器官广泛分布，故造成其感染源的复杂性[7]。因此，致病假丝酵母菌菌株的基因鉴定对明确传染源、协助诊治具有非常现实的临床意义。国外研究显示，阴道假丝酵母菌病主要由白假丝酵母菌引起(占70%～90%)，光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌只占较少比例，国内报道白假丝酵母菌比例约为60%～80%。本研究显示，白假丝酵母菌是RVVC及VVC的主要致病菌，RVVC中白假丝酵母菌所占比例低于VVC，所分离的非白假丝酵母菌以光滑假丝酵母菌居多，这也与既往报道一致[8]。国外学者报道，复发感染的假丝酵母菌菌株的基因型基本保持稳定，仅不到60%菌株发生少量遗传变异，且已建立克隆的菌株亚种在反复感染中发生的重组并非呈渐进式变化[2]。

近年来，分子生物学技术的突飞猛进，白假丝酵母菌基因的鉴定分型方法不断取得质的进展[9]。白假丝酵母菌4号染色体的非编码区的微卫星序列CAI有高度多态性，进行基因扫描后可以获得单位点分析所能达到的最大分辨率，且CAI区有很高的特异性和重复性。文献报道，SSCP为基因突变分析中灵敏度较高的方法。本研究对VVC及RVVC患者阴道分泌物培养的白假丝酵母菌采用CAI-SSCP和基因扫描相结合进行基因型鉴定，结果显示白假丝酵母菌基因型中存在优势基因，分别为基因型CAI 30-45(32.3%)和CAI 32-46(19.4%)，这与国外近期研究结果大致相同[10]。本研究RVVC组102株白假丝酵母菌中，优势基因型占73.5%，由此推测优势基因型菌株在RVVC中具有更强的致病力。

目前临床对RVVC的治疗主要依靠经验给药，造成不同菌源感染均使用同样的药量和疗程，既影响治疗效果也易诱导致病菌基因突变，增加其对常用抗真菌药物的耐药性。近年有报道RVVC发病率持续上升，其病原学表现为致病菌谱发生变化并出现了对常用抗真菌药物的耐药现象，从而导致临床治疗的困难和复杂。本研究显示，RVVC组102株假丝酵母菌对伊曲康唑和制霉菌素的敏感度最高，其次为酮康唑和氟康唑，而克霉唑和咪康唑敏感度较低，但在6种抗真菌药物的敏感度试验中均出现耐药株。因此，在RVVC临床诊治中应强调真菌培养和药物敏感度试验的重要性，建议临床治疗RVVC必须规范化使用抗真菌药物，根据药物敏感度试验结果选用敏感的抗真菌药物进行强化治疗，并且要求治疗须足量、足疗程，必要时采用联合用药。

综上所述，本研究从基因水平研究RVVC的致病菌类型和鉴定其基因型，了解引起RVVC反复发作的病源学原因；临床诊治RVVC时应首先进行真菌培养，根据药物敏感度试验进行个体化规范治疗，避免耐药菌的产生，以提高RVVC的治愈率。

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[8]刘朝阵，王晓莉，廖秦平.复发性外阴阴道假丝酵母菌病的菌群分析与治疗.实用妇产科杂志,2009,25(4):730-732.

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(本文编辑:林燕薇)

Strain identification and drug susceptibility of vaginal isolates from patients with recurrent vulvovaginal candidasis

HuHongzhen,WangLijuan,LiLiping,LuoLiya.

DepartmentofObstetricsandGynecology,MaternalandChildrenCareHospitalofFutianDistrict,Shenzhen518019,China

Correspondingauthor,HuHongzhen,E-mail:huhongzhen929@163.com

ObjectiveTo investigate the strain identification, genotyping and drug susceptibility ofCandidafrom the vaginal isolates from patients with recurrent vulvovaginal candidiasis(RVVC), aiming to provide evidence for diagnosis and treatment of RVVC. MethodsVaginal isolates were obtained from 50 RVVC patients and 50 with vulva vagina candidiasis(VVC)for strain identification. Strain genotyping was carried out using combined methods of CAI-single strand conformation polymorphism(CAI-SSCP)and Genescan analysis. Drug susceptibility test was performed by disk diffusion method. ResultsIn total, 155Candidastrains were obtained from the vaginal isolates in two groups, consisting ofCandidaalbicans(83.2%)and non-Candidaalbicans(16.8%). In the RVVC group, the proportion ofCandidaalbicanswas 78.4%, significantly lower compared with 92.5% in the VVC group (P<0.05). Thirty two CAI genotypes of theCandidaalbicanswere identified from the vaginal isolated between two groups, CAI 30-45 and CAI 32-46 as the dominant genotypes. The proportion ofCandidaalbicansstrains with dominant genotypes did not significantly differ between two groups (P>0.05). The antifungal drug susceptibility of RVVA for Itraconazole was 96.2%, 91.2% for Nystatin, 82.5% for Ketoconazole, 76.5% for Fluconazol, 59.8% for Clotrimazole and 53.9% for Miconazol, respectively. ConclusionsThe distribution of vaginalCandidaspecies in RVVC patients is differed from VVC patients. In the vaginal isolates from RVVC patients, dominant genotype is distributed in theCandidaalbicansstrain.Candidaalbicansyields certain drug resistance to antifungal agents commonly used in clinical practice. Individualized therapy should be implemented based upon the outcomes of drug susceptibility testing.

Candida; Strain identification; Genotype; Single strand conformation polymorphism;

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.09.007

深圳市福田区卫生公益性科研项目(FTWS201340)

518019 深圳，深圳福田区妇幼保健院妇产科(胡红珍，李丽萍，罗丽娅)；510120 广州，中山大学孙逸仙纪念医院妇科(王丽娟)

，胡红珍，E-mail: huhongzhen929@163.com

2016-07-06)