骨髓间充质干细胞对大鼠心肌梗死后心肌营养素-1的影响

李　恩，牛少辉，孙利强，刘宗芳，张丽华，简立国，汪　涛

(郑州大学第二附属医院：1. 心内科；2. 干部病房，河南郑州　450014)



◇基础研究◇

骨髓间充质干细胞对大鼠心肌梗死后心肌营养素-1的影响

李恩1，牛少辉1，孙利强1，刘宗芳1，张丽华1，简立国1，汪涛2

(郑州大学第二附属医院：1. 心内科；2. 干部病房，河南郑州450014)

目的观察大鼠心肌梗死后心肌营养素-1(CT-1)的表达，并用骨髓间充质干细胞移植对其干预，探讨CT-1与心室重塑之间的关系。方法随机选取Wistar雄性大鼠50只，10只作为假手术组(A组)；40只作为心肌梗死组，结扎左冠状动脉前降支(LAD)致心肌梗死24 h后，分别随机抽取一半数量存活大鼠作为心肌梗死对照组(B组)及BMSC移植干预组(C组)。BMSC移植干预组(C组)通过尾静脉注射1 mL BMSC细胞悬液于大鼠体内；A组、B组分别注射无血清培养液DMEM 1 mL，6周后采用Real time PCR及免疫组化、Western blotting分别检测非梗死区CT-1的mRNA及蛋白表达量。结果6周后，B组非梗死区心肌样本中，CT-1 mRNA及蛋白表达量、左心质量指数，同A、C组相比均显著升高，且差异有统计学意义(P<0.05)；C组非梗死区心肌中CT-1 mRNA及其蛋白含量、左心室质量指数均较A组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与B组相比，C组以上指标则明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞能够抑制大鼠心肌梗死后CT-1 mRNA及蛋白表达，从而改善心肌重构。

骨髓间充质干细胞；心肌营养素-1；心肌梗死；心室重塑

冠心病患者当中，心肌梗死的发生率与日剧增，但伴随医疗技术的进步，心肌梗死的死亡率却有所下降，心肌梗死后心室重塑的治疗显得尤为重要[1]。心血管领域都在积极探索各种治疗心肌梗死以及梗死后如何更好的逆转心室重塑的办法，以求改善患者的近期和远期预后。近来，大量研究表明心肌梗死后，炎性细胞因子过度激活，从而介导心室重塑的发生[2]。本研究建立心肌梗死大鼠模型，观察心肌梗死后心肌营养素-1(cardiotrophin-1, CT-1)表达变化，并用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)进行移植干预，探讨BMSC移植是否可能通过抑制炎性因子CT-1的表达，从而逆转心室重塑，进而为临床上治疗心肌梗死后心功能不全、改善患者预后提供理论依据。

1　材料与方法

1.1主要试剂荧光定量PCR试剂(包括如下：SYBR Premix Ex Taq TM，Ribonuclease Inhibitor，dNTP Mixture，Oligo d(T)18 Primers，引物设计，引物合成)由宝生物工程有限公司提供；Trizol Reagent由Invitrogen Life Technologies提供；sp9000试剂盒(北京中杉生物工程公司)；大鼠CT-1免疫组化试剂盒(上海雅吉酶联生物科技有限公司)；PE-CD29抗体、PE-CD106抗体、FITC-CD34抗体、FITC-CD45(Biolegend公司)；L-DMEM培养基、胎牛血清(GIBCO公司)；PBS平衡盐溶液、胰蛋白酶-EDTA(Sigma公司)；流式细胞仪、荧光定量PCR仪(郑州大学基础医学院)。

1.2方法

1.2.1大鼠BMSCs 的分离、培养和扩增随机抽取10周龄雄性Wistar大鼠50只(体质量250～300 g，郑州大学实验动物中心提供)，腹腔注射100 g/L水合氯醛进行麻醉，无菌条件下取出双下肢股骨及胫骨，暴露骨髓腔，无菌5 mL注射器吸取含有肝素(100 U/mL)的L-DMEM培养基，反复冲出骨髓腔中的骨髓至无菌平皿中，制成单细胞悬液。收集此悬液至无菌离心管中，1 500 r/min离心，弃上清，沉淀物用完全培养液(DMEM，150 mL/L胎牛血清、1×100 U/L青霉素、1×100 U/L链霉素)充分混匀并收集；密度梯度法纯化收集细胞，接种于25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中，进行原代培养。待细胞增殖铺至培养瓶底面80%左右时，用2.5 g/L胰酶消化细胞1.5 min，培养液终止消化后，反复温和吹打细胞，制成单细胞悬液，按照1∶3的比例进行传代培养，之后每24 h观察细胞生长情况，至细胞贴壁并彼此融合铺满瓶底，重复以上操作，反复传至第3代[3]。

1.2.2流式细胞仪检测分析鉴定大鼠BMSCs收获第3代生长良好的细胞，胰酶消化吹打收集，1 000r/min 离心5 min，弃上清，PBS轻轻吹打洗涤细胞，重复2次，随后分别加入CD29、CD106、CD34和CD45荧光标记抗体，室温孵育30 min后PBS液洗涤细胞3次，采用流式细胞仪检测分析。

1.2.3动物模型的建立及实验分组50只雄性10周龄Wistar大鼠(体质量250～300 g，由郑州大学实验动物中心提供)，随机抽取10只作为假手术组(A组)，40只作为心肌梗死组，参照MAISEL等提供的方法[4]建立心肌梗死模型。术中以心电图I导联和avL导联ST段立即弓背向上抬高为心肌梗死模型制作成功标志。A组仅在LAD下留置丝线，不结扎。模型建立成功24 h后，将大鼠平均、随机分为2组：心肌梗死对照组(B组)，骨髓间充质细胞干预组(C组)。术后24 h，将前述1 mL细胞悬液，通过尾静脉注射到C组大鼠体内，A组及B组(假手术及对照组)大鼠分别注射1 mL无血清DMEM培养液。饲养6周后(6周后，A组死亡1只，B组死亡5只，C组死亡3只。)最终获得完整大鼠资料，A、B、C组分别为9、15、17只。

1.2.4左心室质量指数的测定6周后，大鼠称重，按照30 mg/kg标准使用30 g/L戊巴比妥腹腔麻醉，开胸并快速取出心脏，分别称取全心(HW)和左心室(含室间隔)质量(LVW)，计算得出左心室质量指数(LVWI∶LVW/体质量)。同时取左室非梗死区(LVNIZ)心肌，液氮猝冻后保存于-80 ℃冰箱，用于做荧光定量PCR和Western blotting。

1.2.5非梗死区心肌CT-1 mRNA的测定采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测左室非梗死区心肌CT-1 mRNA相对表达量，引物序列如下：CT-1基因：sense 5′-TCTATGGCGAGTGGGTGAGC-3′，antisense 5′-AGCAAGCAAGCAAAGAAAGA-3′，产物长度为340 bp。GAPDH基因：sense 5′-BACAACT-

TTGGCATCGTGGA-3′，antisense 5′-AAGGCGC-

TGTCTTGAGACCTAA-3′，产物长度为133 bp。

1.2.6免疫组化法测定非梗死区心肌CT-1蛋白含量部分非梗死区心肌组织块迅速置于预冷的生理盐水中用于Western blotting法，剩余部分非梗死区心肌组织石蜡包埋，连续切片，而后脱蜡水化，滴加稀释(按照说明书指定稀释倍数)的一抗、二抗，用DAB显色封片。显微镜下可见，胞质染色棕黄色为阳性，图像分析软件分析阳性区平均灰度值表示其含量。心肌CT-1蛋白表达测定采用免疫组化法(SP法)[5]检测(按照试剂盒说明书操作)。

1.2.7Western blotting测定非梗死区心肌CT-1蛋白的表达非梗死区心肌组织称量切块，放入机械组织研磨器中。按组织净重∶裂解液=1∶7的比例，加入相应体积裂解液，收集后4 ℃超生破碎15 min(超声3 s停7 s，30%功率)，10 000 r/min离心收集上清(也可以冷冻干燥降解核酸，将冻干的蛋白质样品溶解于1*loading buffer中，100 ℃加热制样)，1∶1加入2*Laemmli样品缓冲液混匀，置100 ℃煮样器加热10 min，10 000 g离心10 min，取上清液转入另一洁净的EP管中，准备SDS电泳。Western blotting测定非梗死区心肌CT-1蛋白，制胶、上样、电泳后，湿转法将总蛋白转移到0.22 μm PVDF膜上。用含50 g/L脱脂奶粉PBST室温封闭1 h；一抗(1∶1 000 稀释)4 ℃过夜结合；PBST洗膜5次，每次5 min；二抗孵育，室温1 h；PBST洗膜5次，每次5 min。ECL+plusTM Western blotting system试剂盒显影，Tanon 5200全自动化学发光成像系统拍照。用Image J图像分析软件获取条带灰度值，除以同组内参GAPDH条带灰度值，测得CT-1蛋白的相对表达量。

2　结　　果

2.1BMSC的分离、培养和扩增体外培养24 h后即有少量细胞贴壁生长，36～48 h出现多个小克隆，72 h后细胞克隆增大，7～10 d细胞迅速增殖，10～12 d 基本铺满瓶底，对细胞进行分离，通过及时反复传代纯化、扩增。倒置相差显微镜下观察扩增培养的BMsCs为成纤维细胞形态,贴壁生长,放射状排列(图1)。

图1骨髓间充质干细胞的培养结果Fig.1 Results of bone marrow mesenchymal stem cells culture

A：大鼠骨髓间充质干细胞培养第7天(×200)；B：大鼠骨髓间充质干细胞培养第3代(×200)。

2.2BMSC的鉴定流式细胞仪分析显示，培养细胞为高纯度的BMSC。83.8%以上BMSC细胞CD29、CD106呈阳性，不表达CD34和CD45(图2)。

2.3大鼠体质量、左心室质量及左心室质量指数的改变

6周后3组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)，C组心脏质量、左心室质量及左心室质量指数高于A组(P<0.05)，而B组以上参数则高于C组(P<0.05，表1)。

图2各组流式细胞仪分析结果

Fig.2 The result of flow cytometry analysis BMSC表达CD106+、CD29+、CD34-、CD45-。

表1各组大鼠体质量、心脏质量、左心室质量及左心室重量指数的改变Tab.1Changes of body weight, heart weight, left ventricular weight and left ventricular mass index of rats in each group

±s)

与假手术组比较，*P<0.05；与AMI对照组比较，▲P<0.05。

2.4大鼠心肌非梗死区CT-1 mRNA和蛋白含量的变化及BMSC的影响同假手术组相比，B组、C组心肌CT-1 mRNA及蛋白表达量均升高明显(P<0.05)。C组与B组相比，心肌CT-1以上参数下降明显(P<0.05，表2)。CT-1蛋白免疫组化结果见图3。Western blotting检测CT-1蛋白含量结果见图4。

表2大鼠非梗死区心肌CT-1蛋白含量及和CT-1 mRNA水平的变化及BMSC干预的影响

Tab.2Changes of CT-1 protein and CT-1 mRNA levels in each group of rats

±s)

与假手术组比较，*P<0.05；与AMI对照组比较，▲P<0.05。CT-1：心肌营养素。

图3各组大鼠心肌CT-1蛋白的免疫组化结果

Fig.3 Immunohistochemical staining of CT-1 protein in the myocardium of rats in each group (×400)

A：假手术组；B：AMI对照组；C：BMSC干预组。CT-1：心机营养素-1，棕黄色为阳性染色，图中可见AMI对照组CT-1表达高于假手术组和BMSC干预组，同时BMSC组CT-1表达高于假手术组。

图4Western blotting法测定各组大鼠心肌CT-1蛋白的表达情况

Fig.4 The expression of CT-1 protein in the myocardium in each group of rats detected by Western blotting

3　讨　　论

近年来，随着人类生活结构的日益变化，心肌梗死患者在一些国家和地区人数骤增，同时此类患者也在不断趋于年轻化。伴随医疗技术的进步，PCI技术的普及，急性心肌梗死早期存活率有明显提高，但急性心肌梗死后发生心室重塑，从而引起的心力衰竭是目前亟待探知和解决的问题。心肌梗死后心室重塑是指心肌梗死后心室大小、形态和组织结构发生变化；同时，心肌梗死后大量炎性因子释放，刺激心肌细胞肥大，间质发生纤维化，左心室扩张，心功能进行性降低，继而发展到心力衰竭。

心肌营养素-1(cardiotrophin-1, CT-1)是一种致心肌肥厚因子，1995年PENNICA等[7]人从小鼠胚胎干细胞的胚状体培养液中分离获得。CT-1的分子结构与炎性细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)家族成员有高度的同源性。成年大鼠以及人类的CT-1 mRNA在心脏、骨骼肌、前列腺和卵巢中都有较高表达[8]。病理状态下，如遗传性高血压、心肌梗死、实验性心肌病、进行性心力衰竭等[9-10]均出现CT-1基因的大量表达。CT-1是目前发现的体外诱导心肌细胞肥大作用最强的细胞因子。

中胚层来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)广泛存在于成体器官和结缔组织中，骨髓来源的间充质干细胞是较为原始的骨髓基质细胞，被称为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)。MSCs目前被认为属异质细胞群，具多种标记和非单一性的特点[11]。BMSCs与造血干细胞共同存在于骨髓中，但不表达造血细胞表面抗原[12]，可用CD29、CD44、CD90、CD105、CD106等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志检测[13]。

BMSC具备较强的分化潜能，可能通过横向分化为心肌细胞，直接分化为内皮细胞、平滑肌细胞参与血管形成[14-15]。以往观点认为，MSC治疗心肌梗死主要与其定向分化为心肌细胞有关[16]，使得科学家们开始广泛关注MSCs在组织修复和基因治疗中的临床应用。然而这一观点目前受到了质疑：再生的心肌细胞是否能够参与原位心肌细胞的收缩；急性心肌梗死后，移植的MSC仅有少部分能够存活下来，即使能够定向分化为有收缩功能的心肌细胞，但是这有限的新生细胞是否存在治疗作用，目前都还没有证据证实。旁分泌作用激活内源性的修复机制上调损伤局部多种生长因子发挥修复受损心脏的作用[17]。由此，已知MSC治疗心肌梗死的机制目前包括心肌细胞分化、血管再生以及抑制心肌细胞凋亡，但仍有许多未知部分。并且，近来有研究证实，MSC可以抑制淋巴细胞增殖、抗原呈递细胞的活化与成熟,移植到受体后具有一定程度的免疫抑制和炎症调节作用[18-20]。

流式细胞术(flow cytometry, FCM)可对液流中排成单列的细胞逐个进行快速定量分析和分选。本研究运用流式细胞术筛选出高纯度的大鼠BMSC，将BMSC通过心肌梗死大鼠尾静脉注射入大鼠体内。通过检测大鼠心梗后非梗死区CT-1 mRNA及蛋白水平变化来探讨BMSC移植与炎性因子CT-1的关系，从而希望找到BMSC移植逆转心室重塑的可能通路。结果发现，心肌梗死对照组和BMSC干预组与假手术组相比，非梗死区CT-1 mRNA和蛋白表达量以及及左心室质量指数明显增高；BMSC干预组与心肌梗死对照组相比，非梗死区CT-1 mRNA和蛋白表达量以及左心室质量指数明显降低，提示BMSC移植可能通过抑制炎性因子CT-1的表达来改善大鼠心肌梗死后的心室重塑。

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(编辑卓选鹏)

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on the expression of cardiotrophin-1 in ventricular remodeling after acute myocardial infarction in rats

LI En1, NIU Shao-hui1, SUN Li-qiang1, LIU Zong-fang1,ZHANG Li-hua1, JIAN Li-guo1, WANG Tao2

(1. Department of Cardiology; 2. Cadres’ Ward, the Second Affiliated Hospital of >Zhengzhou University, Zhengzhou 450014, China)

ObjectiveTo investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation on the expression of cardiotrophin-1 (CT-1) in ventricular remodeling after acute myocardial infarction in rats. MethodsWe randomly divided 50 male Wistar rats into sham operation group A (sham operation group,n=10) and acute myocardial infarction group (n=40). Rats in acute myocardial infarction group were inflicted by ligating the left anterior descending coronary artery. After 24 hours, 40 survived rats were randomly divided into group B (myocardial infarction control group,n=20) and group C (BMSC group,n=20). Rats in group C were treated with BMSC transplantation, and those in group A and group B were treated with serum-free DMEM medium. After 6 weeks, the expressions of CT-1 at the mRNA and protein levels were detected by Real-time PCR method, immunohistochemical and Western blotting methods. ResultsAfter 6 weeks, the expressions of CT-1 at the mRNA and protein levels and left ventricular weight index in the myocardium of non-infraction zone in group B were significantly higher than those in group A and group C (P<0.05). The expressions of CT-1 mRNA and protein and left ventricular weight index in the myocardium of non-infraction zone in group C were significantly higher than those in group A (P<0.05). ConclusionBMSCs transplantation may improve ventricular remodeling after acute myocardial infraction in rats via inhibiting the expressions of CT-1 at the mRNA and protein levels.

bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC); cardiotrophin-1; myocardial infraction; ventricular remodeling

2015-08-05

2015-11-09

河南省科技攻关计划项目(122102310088，132102310142,142102310109)

汪涛. E-mail: ln1025asdfgh@sohu.com

R542.2

A

10.7652/jdyxb201605004

Supported by the Science and Technology Project of Henan Province (122102310088, 132102310142, and 142102310109)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.0905.004.html(2016-08-03)