盐酸米诺环素软膏对微螺钉支抗种植体周围炎龈下伴放线放线杆菌影响的荧光实时定量PCR检测

孙福财　吕汉孝

盐酸米诺环素软膏对微螺钉支抗种植体周围炎龈下伴放线放线杆菌影响的荧光实时定量PCR检测

孙福财吕汉孝

目的 探讨盐酸米诺环素软膏对微螺钉支抗种植体周围炎龈下伴放线放线杆菌（Aa）影响。方法 选取2013年1月至2015年1月15例微螺钉支抗治疗后种植体周围炎的患者，共20种植体，设为观察组；选取同期接受微螺钉支抗治疗的患者14例，共20种植体，经证实无种植体周围炎，设为对照组。记录两组菌斑指数（PLI）、探诊深度（PD）及龈沟出血指数（SBI）。采用实时荧光定量PCR检测Aa。结果 观察组PLI、PD和SBI均显著高于对照组（P＜0.01）；治疗1、3周后观察组PLI、PD和SBI显著降低，治疗6周后有上升趋势，但与治疗前相比差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗前，观察组Aa 16s rDNA数量显著高于对照组（P＜0.01）；治疗1、3周后观察组Aa 16s rDNA数量显著降低，与治疗前相比差异有统计学意义（P＜0.05），治疗6周后有上升趋势，与治疗前相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 盐酸米诺环素软膏治疗微螺钉支抗种植体周围炎，可明显改善种植体周围炎临床症状，疗效确切，其对Aa具有较强的抗菌效果。实时定量PCR是检测龈下菌斑中Aa的可靠方法。

微螺钉 盐酸米诺环素软膏 种植体周围炎 伴放线放线杆菌

随着口腔微螺钉种植技术的逐渐普遍，口腔微螺钉种植体周围炎越来越引起科研人员的重视。伴放线放线杆菌（actinobacillus actinomycetemeomitans，Aa）是非肠源性、能发酵糖类的、兼性厌氧革兰阴性球杆菌，Aa与侵袭性牙周炎高度相关，是侵袭性牙周炎的主要致病菌之一［1］。盐酸米诺环素软膏是一种新型的用于牙周病治疗的局部缓释剂型，其有效抗菌成分为盐酸米诺环素，具有抗菌谱广、耐药菌少、抑制胶原酶代谢、促进牙周组织再生等特点，在治疗牙周炎上已经成为常规用药［2］，故本研究用以治疗口腔正畸中的微螺钉支抗种植体周围炎。本文通过微螺钉支抗种植体周围袋内局部应用盐酸米诺环素软膏，通过荧光实时定量PCR检测Aa的数量，分析盐酸米诺环素软膏的影响。

1　临床资料

1.1一般资料 选取本院2013年1月至2015年1月15例微螺钉支抗治疗后种植体周围炎的患者，共62颗微种植钉，其中20颗发生种植体周围炎，设为观察组；选取同期于本院接受微螺钉支抗治疗的患者14例，共20种植体，经证实无种植体周围炎，设为对照组。纳入标准：无合并全身系统性疾病；近3个月内未口服抗生素或免疫抑制剂；无四环素族药物过敏史；植入种植钉＞0.5年，种植钉无松动，种植钉周围无窦道。排除妊娠期或近期计划妊娠妇女。参考Mombelli 等［3-4］微螺钉支抗种植体周围炎诊断标准：种植钉周牙龈充血水肿，探诊出血，有≥3mm的种植钉周袋。

1.2治疗方法 治疗前，彻底清除种植钉周围龈上菌斑，用生理盐水冲洗并吹干，采用盐酸米诺环素软膏（日本Sunstar INC，H20020306，0.5 g/支）深入牙龈袋底部，缓慢注入药物，包裹牙齿种植钉，并略有溢出。用药后嘱患者2h内不漱口、喝水和进食。1次/周，4周为1个疗程。采用医师指导的方法刷牙。治疗周期为1个疗程。

1.3检测项目 （1）临床检查：记录两组菌斑指数（PLI）、探诊深度（PD）及龈沟出血指数（SBI）。PLI计分方法［5］：无菌斑记为0分；探针尖轻划支抗螺钉表面即可发现菌斑记为1分；肉眼可见菌斑记为2分；大量菌斑记为3分。PD测量方法［6］：采用牙周探针检测龈缘至袋底或龈沟底的距离，将其紧贴种植钉牙面、平行于种植钉牙长轴，稳定支点后，探诊压力保持在 20～25g，采用提插式行走方法，并记录，单位为毫米（mm）。SBI计分方法［7］：以约20g的力控制探针沿种植体龈缘探诊，无出血情况发生为0分，探诊有点状出血为1分，探诊出血在龈沟内呈线状为2分，探诊出现重度出血为 3分。（2）Aa的定量检测：①龈下菌斑采集：在用无菌棉球隔湿的情况下，去除龈上菌斑、软垢，将无菌纸尖插入龈沟中，停留5s后取出，放入1个盛有1ml无菌生理盐水的无菌离心管中，作为患者的微生物样本。样本置于-70℃保存。②荧光定量PCR检测方法：高纯总DNA快速提取试剂盒购自Generay公司，qPCR试剂SuperReal PreMix Plus（with SYBR Green I）购自TIANGEN公司，OD值测量仪器（高精度分光光度计）为Merinton SMA4000，定量PCR仪为CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析软件为BIO-RAD CFX Manager。本实验采用的是外参法，在初始体积的100μl样本中加入7.2×105copies的pEGFP质粒，检测时同时对EGFP的序列进行检测，作为数据分析时的参照。采用高纯总DNA快速提取试剂盒提取种植体周龈下菌斑样本中的DNA，设计Aa 16SrDNA引物序列如下：上游5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游5'-CACTTAAAGGTCCGCCTACGTGCC-3'。PCR产物大小为：593 bp。PCR 扩增反应体系包括2×SuperReal PreMix Plus10μl，上游引物（10μM/L）1μl，下游引物（10μm/L）1μl，DNA 5ng，ddH2O 补足至20μl。使用CFX connect Real-Time PCR System荧光定量PCR仪进行扩增分析。反应程序：50.0℃ 3min，95.0℃15min，95.0℃ 10s，56.0℃ 15s，72.0℃ 40s，共40个循环。1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组患者治疗前后PLI比较 见表1。

表1　两组患者治疗前后PLI比较［分，（x±s）］

2.2两组患者治疗前后PD比较 见表2。

表2　两组患者治疗前后PD比较［mm，（x±s）］

2.3两组患者治疗前后SBI比较 见表3。

表3　两组患者治疗前后SBI比较［分，（x±s）］

2.4两组患者治疗前后Aa 16s rDNA数量（经对数变换后）比较 见表4。

表4　两组患者治疗前后Aa 16s rDNA数量（经对数变换后）比较（x±s）

3　讨论

微螺钉种植体支抗作为绝对支抗现已在口腔正畸界广泛运用。但是，微螺钉种植体容易引发周围炎而导致种植体的松动，导致治疗失败。盐酸米诺环素软膏是一种用于牙周病治疗的新型局部缓释剂型，盐酸二甲胺四环素是其有效成分，具有抗菌谱广、耐药菌少，促进牙周组织再生等特点。盐酸二甲胺四环素主要通过阻止细菌的蛋白合成而发挥其抗菌作用，对龈下菌斑中的革兰阴性菌具有较强的抑菌效果。本资料应用盐酸米诺环素软膏治疗微螺钉支抗种植体周围炎，结果显示，治疗前与治疗后，观察组PLI、PD和SBI均显著高于对照组（P＜0.01）；治疗1、3周后观察组PLI、PD和SBI显著降低，治疗6周后有上升趋势，但与治疗前相比差异仍有统计学意义（P＜0.05）。该组结果表明盐酸米诺环素软膏局部用药后支抗种植体周围炎临床症状得到显著改善，疗效确切。同时观察到4周停药后至6周时，各指标均有上升，可能是由于停药导致药效降低所致。因此，作者建议对于微螺钉支抗种植体周围炎患者采用盐酸米诺环素软膏治疗，应保持长期药物的高浓度。

本文采用实时定量PCR技术对Aa进行定量检测，发现治疗前，观察组Aa 16s rDNA数量显著高于对照组（P＜0.01）；治疗1、3周后观察组Aa 16s rDNA数量显著降低，与治疗前相比差异有统计学意义（P＜0.05），治疗6周后有上升趋势，与治疗前相比差异无统计学意义（P＞0.05）。提示盐酸米诺环素软膏对Aa具有较强的抗菌效果。

综上所述，盐酸米诺环素软膏治疗微螺钉支抗种植体周围炎，可明显改善种植体周围炎临床症状，疗效确切，其对Aa具有较强的抗菌效果。实时定量PCR是检测龈下菌斑中Aa的可靠方法。

［1］William SP， Travess H， Sandy J. The use of osseointegrate in plants in orthodontic patients：in plant and their use in children. Dent Update， 2013，31（5）：1287-1290.

［2］蔡同道.盐酸米诺环素软膏治疗种植体周围炎的疗效观察.中国医学科学，2012，2（11）：168-170.

［3］Mombelli A， van Oosten MA，Schurch E Jr，et al.The microbiota associated with successful or failing osseointegrated titanium implants. Oral Microbiol Immunol，1987，2（4）：145-151.

［4］麦理想，张晟，谢永建，等.微型支抗种植体的临床效果观察.中华口腔医学研究杂志，2011，5（1）：79-84.

［5］Lehmann KM，Kammerer PW，Karbach J，et al.Long-term effect of over denture bar design on per-implant tissues. Int J Oral Maxillofac Implants，2013，28（4）：1126-1131.

［6］牟南南.药物辅助治疗牙周炎前后牙龈卟啉单胞菌的定量检测.大连：大连医科大学，2012：6.

［7］付文，张伟，易小英.盐酸米诺环素与碘合剂治疗种植体周围炎的临床疗效及安全性.实用药物与临床，2014，17（4）：509-512.

Objective To investigate the effect of minocycline hydrochloride ointment on Actinobacillus actinomycetemeomitans for patients with microscrew implants peri-implantitis. Method 15 cases of patients（with 20 microscrew）with microscrew implants peri-implantitis from Jan 2013 to Jan 2015 were used as observation group and another 14 cases（with 20 microscrew）without microscrew implants peri-implantitis were used as control group. Plaque index（PLI），probing depth index（PD）and sulcus bleeding index（SBI）of two groups were determined.Real-Time PCR was used to inspect Actinobacillus actinomycetemeomitans.Results Before and after treatment，the PLI，PD and SBI of observation group were signifi cantly higher than that of control group（P＜0.01）. After treatment for 1st and 3rd weeks，the PLI，PD and SBI of observation group signifi cantly decreased and increased at 6th weeks without signifi cant difference（P＜0.05）.There was signifi cant difference between the 16s rDNA of Actinobacillus actinomycetemeomitans before treatment（P＜0.01）.After treatment，the 16s rDNA of Actinobacillus actinomycetemeomitans of observation group signifi cantly decreased（P＜0.05）.Conclusion Treatment on microscrew implants peri-implantitis with minocycline hydrochloride ointment could improve clinical symptom and inhibitory effect on actinobacillus actinomycetemeomitans.

Microscrew Minocycline hydrochloride ointmentPeri-implantitis Actinobacillus actinomycetemeomitans

浙江省温州市科技局项目（Y20130318）

325000 温州医科大学附属第一医院口腔科