冠心病心肌缺血病证动物模型构建方法与评价的研究进展

2016-10-25李敬文尚坤

中国民族民间医药·下半月 2016年7期

李敬文+尚坤

【摘要】病证结合模型研究方面，大多数建立的是一病一证的病证结合模型，即围绕一种现代医学疾病，在制作的现代医学疾病模型的基础上，渗透中医干预因素后制作一个证的动物模型。文章就冠心病心肌缺血已构建的痰瘀互结证、心血瘀阻证、气阴两虚证、心脾阳虚证动物模型的建立以及评价指标进行归纳整理阐述。病证动物模型能够弥补中医临床辨证客观化指标不足的缺点，为中医的临床实践提供科学依据，以加速实现中医的现代化进程。

【关键词】冠心病；心肌缺血；动物模型；构建方法；综述

【中图分类号】R256.22 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）14-0034-03

Abstract：Model combined disease research， most of the building is a model combined disease and syndrome， a disease that revolve around a modern medicine disease， in the production of modern medical model which is on the basis of the penetration of traditional Chinese medicine after intervention factors to produce a certificate of animal models.In this paper， the sputum silt of myocardial ischemia of coronary heart disease has been build mutual junction resistance syndrome， blood stasis syndrome， qi and Yin deficiency syndrome， mist Yang deficiency syndrome animal model and evaluation index for generalization.Disease animal model could make up for a lack of clinical syndrome differentiation of traditional Chinese medicine objective indicators of faults， which will provide a scientific basis for the clinical practice of TCM， and accelerate the realization of the modernization of traditional Chinese medicine.

Keywords：Coronary Heart Disease （CHD）； Myocardial Ischemia； Animal Model； Building Methods；Review

心肌缺血（myocardial ischemia）是心脏的血液灌注量减少，引发心脏的供氧量不足以及心肌功能代谢紊乱，从而导致心脏不能正常运作的病理状态[1]。中医病证动物模型的病证和病理改变具有与人体相同或相似的特征，所以在实验研究中复制与人类疾病相似的动物模型就显得尤其重要。目前，在推进中医病证研究的客观化和规范化过程中，研究思路主要有造模方法、动物选择和评价体系三方面。本文将造模方法和评价体系进行归纳概述如下。

1 痰瘀互结证动物模型

痰瘀同源相生而互相凝结，主要是指痰瘀能够随气的改变而生成。随着痰瘀互相凝结的部位、性质以及引起病变的不同就有许多不同的临床表现。前有学者认为冠心病在中医学中属于“胸痹”的范畴。痰、瘀是目前临床上常见的两个致病因素，它是指痰水代谢功能出现障碍，导致水津停滞病理产物的形成。瘀血是指来自内部和外部的损伤等原因的病理产物，其实质是经络气血离经，气血不畅和血液停滞于经脉中。本文依据冠心病心肌缺血痰瘀互阻证的病理本质，分别介绍球囊损伤外加高脂肪饮食诱导的动物模型以及高脂肪饮食、静脉注射维生素 D3和异丙肾上腺素模拟冠心病小型猪的动物模型。

1.1 球囊损伤外加高脂肪饮食诱导的痰瘀互结证小型猪动物模型的建立李欣志等[2]通过喂食高脂肪食物和结合冠状动脉血管内皮损伤的方法组合建立小型猪模型。操作方法如下：小型猪喂高脂饮食，每只小型猪每天每次喂食900g食物，连续两个星期。在此基础之上，进行冠状动脉内皮损伤的介入。具体的操作方法：在耳静脉注射戊巴比妥钠（30mg·kg-1）麻醉，后将右侧颈总动脉分离，远心端结扎。放置6F动脉鞘管，从动脉鞘管的侧管注入肝素200U·kg-1。将导引导管置于左冠状动脉开口处，然后做左冠状动脉造影，观察实验小猪冠状动脉的分布情况。造影后将交换导丝放入冠状动脉前降支（LAD）中部，将球囊沿导丝置入LAD 中部。根据实验动物间 LAD 直径的差异进行球囊加压8～12大气压（ATM），持续30s，反复操作3次，扩张后维持球囊压力4～6ATM，同时稍微拉动球囊，距离约0.5～1.0cm。在实验结束时，按照顺序除去导丝和球囊，造影观察 LAD 扩张后，将该导管取出，随后将颈动脉结扎，无菌缝合。术中连续使用心电监护，单个笼子喂养观察。手术结束后给予高脂饲料喂养8周（依旧每只每天900g）。正常对照组仅冠脉造影，不损伤血管内皮细胞，同实验组相同，每只小猪每天喂养饲料900g，仅以普通饲料喂养。

小型猪冠心病痰瘀互结证的评价需对胸痹心痛的主症、兼症、舌象和脉象进行量化统计学处理。同时需要借助体重指数、体表心电图以及无创血流动力学指标。造模成功后的动物模型组血脂水平显著上升，冠状动脉前降支形成粥样硬化斑块，血液的黏稠度也显著增高，并伴有不同程度的心肌缺血，提示为小型猪痰瘀互结证冠心病动物模型建立较成功。结合其他实验方法进行整体性分析，此种造模方法稳定性较好。但该动物模型所需费用较高，同时对实验要求也较高，技术手法较为严苛，难度也较大，应用不广泛。

1.2 高脂饮食和静脉注射维生素 D3（VD3）和异丙肾上腺素复制冠心病痰瘀互结证小型猪动物模型的建立潘永明等[3]采用实验小型猪，适应6周后，按血脂水平和体重随机分为3个组，每组小型猪5只，即正常对照组（control，Ctr）喂基础饲料；高脂组（high fat-cholesterol diet，HFC）以高脂饲料喂养；痰瘀互结证慢性心肌缺血组（chronic myocardial ischemia，CMI）在喂食高脂饲料的同时，于造模 0、4、8周的时候耳缘静脉注射5万IU/kgVD3，从第12周开始时，每周耳缘静脉注射1次异丙肾上腺素25μg/kg，直至第24周结束[4]。小型猪连续喂养24周，按照体重的2.5%给予饲料喂量，均分成两等份于1日饲喂完，每两周称重并更换1次饲料量，高脂饲料配方为15%起酥油，10%蛋黄粉，1.5%胆固醇，73.5%基础饲料。

此模型试验期间，观察到痰瘀互结证慢性心肌缺血小型猪有明显的心率加快、喘息急促、心电图异常、舌质暗紫等症状，表明该实验动物模型可以成功模拟中医痰瘀互结证冠心病的病因和病理过程，且其病程相对缓慢。血液流变学、心肌酶代谢、脂质代谢和炎症指标也可作为评价该模型的生物学基础，这为中医冠心病痰瘀互结证的研究和药物干预机制提供了参考依据。该实验方法可操作性较高，而且操作较为简单，应用更广泛。

2 心血瘀阻证动物模型

心血瘀阻证的临床表现包括心胸憋闷疼痛以及口、唇部呈暗红色，指甲发青紫，或出现有瘀斑、脉涩等症状。经反复调查研究统计，间断反复冷应激方法与垂体后叶素联合造模以及冠脉结扎法两种动物模型效果较好。

2.1 反复间断冷应激的方法与垂体后叶素联合造模法谷万里等[5]将实验大鼠随机分为正常组、硝酸甘油治疗组和生理盐水对照组，随后将实验大鼠进行随机编号、标记、称重。每组实验动物各8只。硝酸甘油治疗组和生理盐水对照组每日8∶[KG-*3/5]30于-（5±1）℃低温环境中将大鼠分别置于笼内，连续3h（采用可调温冰箱，透过玻璃盖可进行观察），使大鼠全身暴露于低温环境。然后再恢复与室内温度相同的温度（20±1）℃，并连续3d于腹腔注射垂体后叶素20U/（kg·d）。三组按照相同的常规方法喂养。于造模成功后当天，连续3d，给予治疗组大鼠硝酸甘油0.45mg/（kg·d）；对照组大鼠给予0.9%生理盐水7mL/（kg·d）。最后一次给药后30min，观察大鼠的一般情况。

实验观察表明，硝酸甘油治疗组和生理盐水对照组中实验大鼠出现烦躁、多动的现象。随后出现反应迟钝、耳色暗红、蜷缩懒动、爪尾部发紫、饮水量明显减少等血瘀的症状。结果表明，开始时大鼠生理功能代偿性的增强引起了血管内皮细胞的损伤，血管通透性显著增加、血浆ET含量增多，NO含量减少。同对照组比较差异具有统计学意义，说明模型建立较成功。

2.2 冠脉结扎法构造心血瘀阻证动物模型使用盐酸氯胺酮20%进行腹腔麻醉（80kg/kg），将背位固定，颈部去毛。然后将上皮组织剪开，颈前肌分离，让气管外露，用20号穿刺针头经口插入气管穿刺，另一端口连接微型人工呼吸机。将胸部脱毛，消毒，纵向切开皮肤约2cm，作钝性分离（第4或第5肋间），剪断左侧胸廓第4肋。打开胸腔，剪开心包膜。然后以3/8不锈钢小圆针和6/0号丝线穿过肺动脉圆锥于左心耳交界下约1～2mm处，结扎左冠状动脉左前降支，结扎前后需记录Ⅱ导联心电图[6-7]。若结扎部位以下出现心肌苍白，脉搏微弱，ST段弓背向上显著则表明模型的构造成功。然后快速的将胸腔缝合，待动物可以自主呼吸，即停止人工呼吸。造模成功后观察3h，处死动物，进行采血随后取出心肌组织。对以下指标进行测定：MDA的测定、SOD、TXB、6-keto-PGF含量等。

冠状动脉结扎所致的心肌缺血动物模型，其SOD、6-keto-PGF值显著降低，MDA、TXB明显上升。冠状动脉结扎可导致大鼠血瘀的模型，实验结果表明，如果涉及到胸痹所致的心血瘀阻模型的实验研究，可采用结扎动脉法。

3 气阴两虚证动物模型

以临床常见的气阴两虚证为切入点，发现慢性间歇性缺氧模型小鼠特征表现为摄食量降低、体重减小、自发活动行为的改变、心电图T波持续性升高等异常的出现[8]。可部分模拟气阴两虚证的主要临床表现，并伴随氧化应激异常等病理变化。同时发现近老龄大鼠情况与人有一定的同一性，所以近老龄、老龄大鼠可用来研究人类的气阴两虚证。

3.1 采用慢性间歇性缺氧手段构建气阴两虚证动物模型将30只雄性ICR小鼠随机分为三组，空白对照组、钠石灰组、低压氧仪组。每组ICR小鼠10只放于同一笼内喂养，每组小鼠每天给食物100g，饮水正常。空白组每日喂养情况正常，早晨灌服0.02 mL·g-1生理盐水；钠石灰组和低压氧仪组每晚21时开始禁食，第二日清晨8时分别放入200mL密闭广口瓶中（每个瓶子中预先加入15g钠石灰）同时将低压氧仪置于缺氧箱中（氧分压调至7%～8%），持续缺氧20min；每日1次，连续42d[9]。

3.2 评价结果显示，在不同时间段下小鼠各项指标的变化趋势基本一致。具体表现为：体重在前14d增长比较缓慢，直至第3周时呈逐渐下降趋势；进食量一直呈下降趋势；行走格数在第14～35d明显减少，而直立次数则一直呈上升趋势，而且与空白对照组相比较，理毛、搔抓、大、小便次数也明显增多；心电图则表现出心率加快，T波呈逐渐抬高趋势等现象。钠石灰组、低压氧仪组与空白对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。证实钠石灰缺氧法与低压氧仪缺氧法两种不同的缺氧条件，二者诱导的慢性间歇性缺氧小鼠模型都能模拟形体消瘦、食欲不振、体倦乏力、烦躁、心悸、脉细数等气阴两虚证的主要临床特征[10]。除此之外，2种不同缺氧方式的相关性分析结果也显示出钠石灰缺氧法与低压氧仪缺氧法具有非常显著的相关性。

4 心脾阳虚证动物模型

在有关脾阳虚证的研究中[11-15]，结合脾阳虚证两大症状群的评价，脾阳虚的症状分为两类，分别是阳虚症状：喜温畏寒、四肢冰冷等症状；脾虚症状：乏力、消瘦、便溏、腹痛、腹胀[16-17]。通过观察大鼠的行为以及肛门温度的测定来初步评估建立的模型。以上所述心脾阳虚的观察结果，可供心脾阳虚证动物模型的研究作定性参考。

4.1 心脾阳虚证大鼠模型的建立适应性喂养大鼠一星期，然后将大鼠随机分为五个实验组：正常组、模型组、低剂量治疗组、中剂量组、高剂量组。每组20只且雌雄各半。正常组饮水正常，普通食物喂养；模型组、治疗药物低剂量组、中剂量组和高剂量组均施行肩胛骨间棕色脂肪组织（ brown adipose tissue，BAT）切除术，术后于19℃环境高脂饲料喂养。实验22 d开始给予脑垂体后叶素（10U·kg-1）皮下多点注射，正常组给予等容量生理盐水。每日1次，连续7d。最后一次分别按照梯度剂量给药低剂量组、中剂量组和高剂量组，随后进行心电图检查，取心脏，进行心脏灌流，正常组和模型组给予生理盐水灌流。

4.2 评价在实验动物模型中，发现小鼠肛门附近有异物，懒动并伴有大便稀溏，喜欢扎堆，无光泽。同时，模型组中小鼠的体重，肛门温度等指标与正常组小鼠相比较差异有统计学意义。该动物模型的建立综合了以下三种方法，分别为：高脂肪食物喂养、BAT 切除术以及脑垂体后叶素皮下多点注射，隔日置于阴凉寒冷环境刺激。在动物模型的复制过程中，加强对“伤阳”脾虚证的设计，采用去除BAT的方法能够显著降低小鼠产生热量的来源[18]。为使其阳气衰弱，则采用寒冷环境刺激，旨在模拟“饮食不节”、“寒伤中阳”的症状，使脾阳虚证造模的阳虚、脾虚环节更为可信。实验结束后注意到，模型组的体量、肛温在造模后都有明显下降的趋势，同造模前相比差异有统计学意义，说明此动物模型效果较好。

5 小结

中医病证动物模型不应该局限于单一的改变局部生理状况，同时应与系统生物学、基因组学以及光谱分析学相结合，观察实验整体的变化，包括DNA、mRNA、蛋白质、代谢物等复杂检测指标之间的变化，才能真正地促进了中医病证动物模型的发展，从整体的角度，逐渐对传统中医理论探索和研究方面有更深刻的理解，并逐步深入研究探讨“证”的实质[19-20]。

复制冠心病心肌缺血病证动物模型的方法日渐成熟，应用也越来越广泛。目前已取得了一定的发展，其设计思路已经遵循了“因-脉-证-治”思路中的某些环节。中医辨证体系的建立和不断发展与创新对中医药的发展起到了举足轻重的作用。本文通过对复制冠心病心肌缺血病证动物模型构建方法的切入，同时对心电图、组织染色检查和血清酶学等综合指标的评价研究近况的探讨，希望能通过不断改善中医病证动物模型的构建方法以及评价机制，建立与传统中医理论相适应的量化可测的实验方法，并不断完善，为药物研究所用。

参考文献

[1]邢建华，翟红莉.中医证候动物模型研究近况[J].中国疗养医学，2007，16（2）：68-69.

[2]李欣志，刘建勋，任建勋，等.痰瘀互结证冠心病小型猪模型的建立[J].中国中西医结合杂志，2009，29（3）：228.

[3]潘永明，陈亮，徐孝平，等.痰瘀互结证慢性心肌缺血小型猪模型的建立[J].中国比较医学杂志，2015，9，25：9.

[4]卢志强，张艳军，等.心肌缺血模型的制作方法研究进展[N].中国药理学通报，2012，28（8）：1053-1057.

[5]谷万里，史载祥，贾海忠，等.寒凝血瘀心肌缺血动物模型的建立和评价研究[J].中药药理与临床，2009，25（4）：82-84.

[6]陈清华，莫莉，袁肇凯，等.养心通脉方有效成分部位抗心肌缺血的实验研究[J].中华中医药学刊，2008，26（9）：1910.

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[9]王文萍，柴程芝，寇俊萍，等.2种慢性间歇性缺氧小鼠模型模拟气阴两虚证临床指征的比较研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，9；17（17）：171-176.

[10]邓铁涛.中医证候诊断标准[M].广州：广东科学技术出版社，1990： 12.

[11]唐汉庆，张文通，王勇，等.脾阳虚证大鼠胃生长素改变的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，2010，16（12）：1136.