普罗布考联合瑞舒伐他汀对糖尿病大鼠对比剂急性肾损伤保护作用的研究

曹　媛



普罗布考联合瑞舒伐他汀对糖尿病大鼠对比剂急性肾损伤保护作用的研究

曹媛

目的探讨普罗布考联合瑞舒伐他汀对糖尿病大鼠对比剂急性肾损伤的保护作用。方法SD大鼠100只，随机分为空白对照组(20只)及造模组(80只)，利用链脲佐菌素进行糖尿病造模，并利用优维显碘普罗胺对造模成功的76只大鼠进行对比剂造影，同时将上述大鼠随机平均分为联合用药组(灌胃给予普罗布考及瑞舒伐他汀)、普罗布考组(仅灌胃给予普罗布考)、瑞舒伐他汀组(仅灌胃给予瑞舒伐他汀)、模型组(仅灌胃给予生理盐水)。观察造影前、造影后24、48及72 h各组大鼠血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)的变化情况；观察各组大鼠肾脏病理标本；检测各组大鼠造影72 h后氧化应激相关指标变化情况(超氧化物歧化酶、超敏C反应蛋白、丙二醛及谷胱甘肽过氧化物酶)。结果与模型组比较，联合用药组、普罗布考组及瑞舒伐他汀组造影24、48及72 h后Scr、BUN均明显下降，联合用药组上述指标改善程度明显优于普罗布考组及瑞舒伐他汀组；联合用药组大鼠病理切片情况均明显优于造模组、普罗布考组和瑞舒伐他汀组，其肾小管损伤评分为0.62分，明显优于造模组(2.5分)、普罗布考组(1.62分)和瑞舒伐他汀组(1.57分)；造影72 h后，联合用药组超氧化物歧化酶、超敏C反应蛋白、丙二醛及谷胱甘肽过氧化物酶改善程度明显优于普罗布考组及瑞舒伐他汀组。结论普罗布考联合瑞舒伐他汀对糖尿病大鼠对比剂急性肾损伤具有较好的保护作用，其效果优于各单一用药。

普罗布考；瑞舒伐他汀；对比剂；急性肾损伤；糖尿病

0　引言

随着现代造影技术普及程度的不断增加，对比剂的使用亦明显增多[1]。然而，由此所导致的对比剂损伤(Contrast-induced nephropathy，CIN)发病率亦明显升高[2]。CIN为使用对比剂后48～72 h中，患者血清肌酐(Serum creatinine，Cr)的绝对值升高0.5 mg/dL或其相对值升高25%[3-4]。目前，CIN已成为医院获得性肾功能衰竭的三大主要原因之一，相关流行病学研究结果表明，CIN的危险因素主要包括糖尿病、高血压、高龄及肾脏功能不全等，其中糖尿病是对比剂肾损伤发生的最常见危险因素之一[5-6]，但目前针对糖尿病患者CIN治疗的相关研究较为缺乏，临床亦无权威治疗手段。尽管在临床中逐渐开始分别使用瑞舒伐他汀或普罗布考单一给药来治疗对比剂肾损伤，但其联合用药是否对糖尿病对比剂肾损伤具有更好的治疗作用，目前国内相关的研究及报道并不充分。为此，本研究通过探讨该联合用药对大鼠对比剂损伤的保护作用，为临床用药提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物健康清洁级SD大鼠100只，雌雄不分，体重150～200 g，周龄8～10周，由西安交通大学动物实验中心提供并代饲养，饲养条件为标准饲养，日常光照及自由饮水。动物合格证编号：SCXK(陕)2014-0219。

1.1.2主要实验药品与仪器瑞舒伐他汀(阿斯利康制药有限公司；批号：08097812；规格：10 mg/片)，普罗布考(齐鲁制药有限公司；批号：2014090823；规格：125 mg/片)，优维显碘普罗胺(德国拜耳医药公司；批号：90982107；碘含量：370 mg/mL；规格：50 mL/瓶；渗透压为774 mOsm/kgH2O)，STZ(链脲佐菌素，美国SIGMA公司，批号：87098921)。ELX800型全自动酶标仪(美国BIO-TEK公司)；LX20型全自动生化仪(美国贝克曼公司)；CX41型生物显微镜(日本OLYMPUS公司)；MODEL722型紫外分光光度计(上海观科分光仪有限公司)。

1.2实验动物分组及给药方法

1.2.1大鼠给药剂量根据药物使用说明书，瑞舒伐他汀和普罗布考的人体用药一般剂量分别为10 mg/d及450 mg/d，按照文献公式[7]：大鼠剂量(mg/kg)=成人剂量(mg/kg)×6.25，成人体重按60 kg计：瑞舒伐他汀的人体正常剂量为：10 mg/60 kg=0.167 mg/kg，换算每只大鼠(按150 g标准体重计)每天用量：0.167×6.25=1.043 mg/kg；普罗布考的人体正常剂量为：450 mg/60 kg=7.5 mg/kg，换算每只大鼠(按180 g计)每天用量：7.5×6.25=46.87 mg/kg。

1.2.2建立糖尿病大鼠模型随机选取80只大鼠分为造模组，在禁食12 h后给予一次性单剂量STZ腹腔注射(剂量：60 mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。注射后72 h和7 d后，分别对所有大鼠进行尾静脉取血，利用葡萄糖氧化酶法测其血糖，共计76只大鼠达到糖尿病大鼠的成模标准(非禁食血糖≥16.65 mmol/L)[8]，其中1只大鼠未造模成功而弃除，3只大鼠造模期间死亡。

1.2.3实验动物分组将上述剩余20只正常大鼠分为正常对照组，将造模成功的造模组大鼠(76只)随机平均分为4个小组：普罗布考组、瑞舒伐他汀组、普罗布考与瑞舒伐他汀联合用药组(联合用药组)及模型组，每组19只。

1.2.4大鼠给药及实验方法根据“1.2.2”项中糖尿病造模并饲养7 d后，按照10 mg/kg的剂量对造模组大鼠进行优维显碘普罗胺尾静脉注射，注射造影完成后1 h，分别对各组大鼠进行灌胃给药，普罗布考组给予普罗布考7.5 mg/kg；瑞舒伐他汀组给予瑞舒伐他汀1.043 mg/kg；联合用药组同时给予普罗布考7.5 mg/kg及瑞舒伐他汀1.043 mg/kg；模型组及正常组大鼠均仅给予等量生理盐水灌胃。

各组大鼠在造影前均禁水禁食12 h，并分别于造影前及造影后48 h和72 h对各组大鼠进行内眦取血，分离血清并保存于-80 ℃冰箱备用。实验72 h取血完成后处死各组大鼠，剖腹取双侧肾，其中一侧肾脏利用多聚甲醛(pH=7.4)固定保存，用石蜡包埋制片；另一侧肾脏则利用玻璃匀浆器制作成大鼠肾脏组织匀浆。

1.3大鼠检测指标①利用全自动生化仪检测各组大鼠造影前，造影后24、48、72 h血清中血肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)等肾功能指标含量。②大鼠肾脏病理及肾小管评分[9]：对“1.2.4”项中得到的大鼠肾脏切片进行HE染色，并利用光镜观察其病理变化情况。利用Paller法对大鼠肾小管进行评分，即根据肾小管萎缩及扩张程度、肾小管上皮细胞空泡变性及坏死程度和肾脏间质纤维化程度，重度、中度、轻度及无分别计为3、2、1及0分。各组大鼠切片均连续观察10个不重叠的高倍视野，并计算其平均分。③大鼠肾组织匀浆氧化应激相关指标的检测：造影72 h后，分别采用黄嘌呤氧化酶法、双位点夹心酶联免疫吸附法、硫代巴比妥酸比色法及化学比色法分别检测各组大鼠肾组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、超敏C反应蛋白(hr-CRP)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量。

2　结果

2.1各组大鼠肾脏功能指标变化情况与空白对照组比较，造影24 h后，模型组Scr及BUN含量均明显升高25%以上，提示本实验中糖尿病对比剂肾损伤造模成功；与空白对照组比较，模型组、联合用药组、普罗布考组及瑞舒伐他汀组造影24、48及72 h后，Scr、BUN均明显上升，各组相关指标与空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，联合用药组、普罗布考组及瑞舒伐他汀组造影24、48及72 h后，Scr、BUN均明显下降，各组相关指标与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；联合用药组上述指标改善程度明显优于普罗布考组及瑞舒伐他汀组，各组相关指标与联合用药组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、图2。

图1　造模前后各组大鼠血清Scr含量变化情况

注：与联合用药组比较，*P<0.05，**P<0.01

图2　造模前后各组大鼠血清BUN含量变化情况

注：与联合用药组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2各组大鼠HE染色肾小管损伤程度检测情况空白对照组大鼠肾脏切片可见其肾小管结构正常，肾小管上皮细胞未出现明显损伤；模型组大鼠中可见部分肾小管结构破坏，肾小球内皮及上皮细胞出现变性、肿胀，大量肾小管上皮细胞出现空泡变性、细胞及刷状缘脱落、肾间质炎性细胞浸润及灶性水肿，与空白对照组肾小管上皮细胞损伤评分相比显著增加(P<0.05)；普罗布考组及瑞舒伐他汀组大鼠病理切片情况基本一致，均可见肾小球系膜细胞以及基质中度增生，毛细血管袢管腔无压迫，其肾小管上皮细胞损失评分相比较，差异无统计学意义(P>0.05)；联合用药组中可见大鼠肾小管上皮细胞出现部分空泡变性及轻度肿胀，肾间质出现少量炎性细胞浸润现象，其较模型组大鼠损伤明显减轻，肾小管损伤评分分别与普罗布考组及瑞舒伐他汀组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。表1、见图3。

表1　各组大鼠肾小管损伤评分比较情况(分)

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与联合用药组比较，#P<0.05

2.3各组大鼠肾组织匀浆氧化应激相关指标的检测情况造影72 h后，联合用药组、普罗布考组及瑞舒伐他汀组大鼠肾组织匀浆中SOD及GSH-PX较模型组均明显升高，各组相关数据与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；造影72 h后，联合用药组、普罗布考组及瑞舒伐他汀组大鼠肾组织匀浆中hr-CRP及MDA较模型组均明显降低，各组相关数据与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；造影72 h后，联合用药组相关氧化应激指标改善程度均明显优于普罗布考组及瑞舒伐他汀组，联合用药组相关数据与各组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3　讨论

近十几年来，由于介入诊疗技术在冠心病等疾病治疗中的发展突飞猛进，对比剂的应用亦越来越广泛[10]，该药物在对临床诊断与治疗中起着重要作用的同时，不良反应亦不容忽视，其中最常见的即对比剂肾损伤(CIN)[11-12]。糖尿病不仅是冠心病常见的并发症，同时还是CIN的高危因素，根据相关流行病学研究结果，在糖尿病患者中，CIN的总发生率高达5.7%～29.4%，相比非糖尿病对比剂肾损伤，糖尿病对比剂肾损伤对肾脏的损害更大，预后也更差[13]。目前临床对于糖尿病对比剂肾损伤的治疗方法有很多，除水化治疗之外，他汀类等降血脂药物也能够有效预防糖尿病对比剂肾病。普罗布考具有抗脂质过氧化及调节血脂的药理作用，临床广泛应用于血脂调节及抗动脉粥样硬化[14-15]。瑞舒伐他汀作为重要的他汀类药物，不仅能够有效降低血脂，同时还可用于预防缺血性肾病[16]。

图3　光镜下各组大鼠肾脏病理形态学变化

注：A.空白对照组,B.模型组,C.联合用药组,D.普罗布考组,E.瑞舒伐他汀组

注：a.联合用药组与模型组比较；b.普罗布考组与模型组比较；c.瑞舒伐他汀组与模型组比较；d.联合用药组与普罗布考组比较；e.联合用药组与瑞舒伐他汀组比较

本研究利用STZ进行糖尿病大鼠造模，同时在此基础上利用造影剂注射完成了糖尿病大鼠CIN模型，该方法成熟可靠，而造影24 h后，模型组Scr及BUN含量均明显升高25%以上，说明本实验造模成功。在肾功能相关血清指标观察中，造影24、48及72 h后，联合用药组、普罗布考组及瑞舒伐他汀组Scr、BUN含量较模型组均明显下降，而联合用药组上述指标改善程度明显优于普罗布考组及瑞舒伐他汀组。病理切片结果显示，联合用药组大鼠肾小管上皮细胞出现部分空泡变性及轻度肿胀，肾间质出现少量炎性细胞浸润等现象，肾脏损伤较模型组、普罗布考组及瑞舒伐他汀组明显减轻。上述实验结果说明了普罗布考与瑞舒伐他汀联合用药对大鼠肾脏功能的改善效果明显优于单一给药。其机制可能在于瑞舒伐他汀可通过抑制氧化亚氮衍生物的氧化，上调肾脏血管内皮细胞一氧化氮合成酶等作用来保护肾脏功能[17]；而普罗布考可抑制机体致炎因子的基因表达，对自由基介导的炎症具有较强的改善作用，因此，两药联合使用可产生协同作用，提高治疗效果。此外，自由基反应是正常机体的一类防御机制，自由基的产生与清除之间失衡是导致组织损伤的重要原因[18]。各组大鼠肾组织匀浆中相关氧化应激指标水平的比较结果提示，联合用药的方法对于糖尿病CIN大鼠SOD及MDA等指标的改善程度明显优于单一用药组，表明普罗布考与瑞舒伐他汀联合用药较单一药物治疗能够更有效地缓解糖尿病CIN大鼠肾脏氧化应激情况，对其组织损伤具有更好的保护作用。

由于相关文献的缺乏等原因，本研究亦存在一些不足：首先，实验设计中仅针对不同的用药方法进行研究，而对于同一治疗方法的不同给药剂量则缺少探讨，这种剂量与治疗效果的相关性在后期研究中应该予以阐述；其次，本研究结果相关机制仍不明确，还需要深入讨论；再次，由于本实验是为临床优化用药做理论基础，因此，还需在后期探讨中对联合用药后的不良反应情况进行详细观察；最后，本实验中缺少对各组大鼠尿液中相关指标的检测，而对肾功能相关的血清指标检测项目也不足，后续研究中应予以补充。

综上所述，普罗布考联合瑞舒伐他汀较单一用药能够更有效地保护糖尿病大鼠对比剂急性肾损伤，值得展开深入研究。

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Protective effects of probucol combined with rosuvastatin on the diabetic contrast-induced nephropathy in rats

CAO Yuan

(Baoji Renmin Hospital,Baoji 721000,China)

ObjectiveTo explore the protective effect of probucol combined with rosuvastatin on the diabetic contrast-induced nephropathy in rats.MethodsTotally 100 SD rats were randomly divided into five groups:blank control group,model group,probucol group,rosuvastatin group and combination group.STZ was injected to make the diabetic model in the model group,probucol group,rosuvastatin group and combination group.Contrast agent was injected into such groups.Serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN) were observed before making model,after making model for 24 h,48 h and 72 h.The pathologic changes and SOD,MDA,GSH-PX and hr-CRP levels were observed.ResultsScr in model group were all increased over 25% after contrast agent injection for 24 h,48 h and 72 h.Compared with model group,the Scr and BUN levels decreased in probucol group,rosuvastatin group and combination group,and the promotion of combination group was better than probucol group and rosuvastatin group.The renal tubular damage score was 0.62 in combination group,which was highter than of model group (2.50),probucol group (1.62) and rosuvastatin group (1.57).The improvement of SOD,MDA,GSH-PX and hr-CRP levels in combination group were better than those of other groups.ConclusionProbucol combined with rosuvastatin has protective effect on the acute kidney injury induced by contrast agent in rats,which is better than the single use of probucol or rosuvastatin.

Probucol;Rosuvastatin;Contrast agent;Acute kidney injury;Diabetes

2016-01-25

宝鸡市人民医院药剂科，陕西 宝鸡 721000

10.14053/j.cnki.ppcr.201609008