10% EDTA、5%硝酸用于大鼠颞骨脱钙处理的效果对比观察

卓洋，王巧，杨聪颖，陈昊，李爱民

(徐州医学院附属连云港医院，江苏连云港222000)



10% EDTA、5%硝酸用于大鼠颞骨脱钙处理的效果对比观察

卓洋，王巧，杨聪颖，陈昊，李爱民

(徐州医学院附属连云港医院，江苏连云港222000)

目的观察并比较10%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和5%硝酸脱钙处理大鼠颞骨的效果。方法 SD大鼠10只，随机分为EDTA组和硝酸组，取出大鼠颞骨后分别置于10% EDTA、5%硝酸脱钙液中进行脱钙处理。观察两组脱钙效果，记录脱钙时间，采用甲苯胺蓝染色进行颞骨组织形态学观察，采用免疫荧光双标染色检测α-tubulin蛋白、水通道蛋白1(AQP1)。结果 两组取材过程中，颅骨硬度适当，颞骨可轻松切下，无砂砾感，切下的颞骨无松散及组织脱落。硝酸组脱钙所需时间分别为(11.20±0.83)d、(26.20±2.38)min，两组相比，P<0.05。EDTA组颞骨整体形态保持完好，蜗管、镫骨肌、岩动脉、神经元、雪旺细胞、郎飞结、神经干可清晰辨识；硝酸组颞骨整体结构保存较理想，神经元形态保持尚可，但存在骨质染色不均、雪旺细胞崩解、轴突肿胀、郎飞结消失现象。EDTA组颞骨脱钙后AQP1、α-tubulin蛋白定位准确，组织区分度高；硝酸组由于细胞膜中AQP1遭受破坏、位于微管内的α-tubulin蛋白漏出细胞，荧光消减明显，组织形态保持较差。结论 10% EDTA和5%硝酸用于大鼠颞骨脱钙处理效果均较好，两种脱钙液均适用于普通病理及结构观察，若用于蛋白定量及定性方面研究，应首选10% EDTA。

骨脱钙技术；乙二胺四乙酸二钠；硝酸；颞骨

颞骨参与构成头颅的侧部与颅底，其中穿行面神经、脑膜中动脉及分支，颞骨同时容纳听觉器官及其附属结构，颞骨骨折可造成上述结构损伤，引起相应并发症[1]。既往研究主要通过打开颞骨获取目标组织[2]，此法简便快速，可获取目标组织进行单独研究，但易造成组织结构破坏(尤其是血管、神经等柔软且难以取材的组织)。骨脱钙技术成熟，为病理常规技术，但多用于单纯的骨组织病理诊断。目前病理科常用的脱钙液包括10%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)和5%硝酸等，但不同性质的脱钙液对脱钙后颞骨内部组织形态及蛋白定位、含量的影响少有报道。2015年6～10月，我们分别采用10% EDTA和5%硝酸对大鼠整个颅骨进行脱钙处理，观察并比较脱钙后颞骨内结构及蛋白定位、含量变化，为后期研究提供参考。

1　材料与方法

1.1实验动物与材料正常成年健康雄性SD大鼠10只，体质量200～250 g，随机分为EDTA组及硝酸组各5只。4%、10%多聚甲醛，0.25%甲苯胺蓝染液，0.5%冰醋酸溶液，梯度乙醇，二甲苯，兔抗大鼠水通道蛋白1(AQP1)一抗，小鼠抗大鼠α-tubulin蛋白一抗，CY3标记山羊抗兔二抗，Fitc标记山羊抗小鼠二抗，山羊血清工作液，DAPI工作液。Leica RM2235超薄切片机，奥林巴斯荧光显微镜。

1.2颅骨的取材及固定两组大鼠以10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉，剑突下剪开皮肤、暴露心脏，生理盐水于左心室内灌注至大鼠四爪及双肺颜色变白，换用新鲜配制的4%多聚甲醛经左心室灌注、固定，灌注成功的标志为大鼠全身僵硬，所灌注的大脑色白、质硬。于颈枕交界处将大鼠断头，锐性清除头颅皮肤、外耳、肌肉等附属组织，暴露出完整颅骨；自枕骨大孔处向前去除顶骨，掀起大脑，剪断颅神经，去除大脑；将颅骨置于10%多聚甲醛溶液内，4 ℃冰箱内固定4 h，0.9%生理盐水冲洗后进行脱钙处理。

1.3脱钙液配制及颅骨脱钙方法EDTA脱钙液：EDTA 10 g加入100 mL的双蒸水中，加入NaOH(1 mmol/L)将pH调至9.0。硝酸脱钙液：将浓硝酸5 mL缓慢加入95 mL的双蒸水中。EDTA组和硝酸组分别采用10% EDTA、5%硝酸脱钙液进行脱钙处理。将固定好的头颅标本置于相当于10倍颅骨体积的脱钙液中。加盖放入4 ℃冰箱，定期更换脱钙液，观察脱钙情况，以切片机刀片切割颅骨柔软且无砂砾感为脱钙终点。

1.4颞骨石蜡切片的制备取两组脱钙完全后的头颅以蒸馏水冲洗10 min，去除标本中的脱钙液，将大鼠头颅置于头颅模具中，分别沿头颅正中及双眼眶后缘连线取出颞骨。常规脱水、透明、包埋，沿矢状位做厚度10 μm连续切片，制备好的石蜡切片置于70 ℃烤箱中烘烤4 h，常规脱蜡及梯度乙醇水化后分别进行甲苯胺蓝染色及免疫荧光双标染色。

1.5颅骨组织形态观察采用甲苯胺蓝染色法。将标本置于37 ℃的0.25%甲苯胺蓝染缸内3 min，流水洗去浮色，0.5%冰醋酸溶液1 min，梯度乙醇脱水5 s，二甲苯透明30 s，封片，显微镜下拍照。

1.6颅骨组织中AQP1、α-tubulin蛋白检测采用免疫荧光双标染色。将标本以0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次，浸入抗原修复液中，100 ℃水浴锅内水浴10 min；0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次；加入山羊血清工作液37 ℃封闭60 min，倾去，不洗；加入AQP1(1∶500)及α-tubulin(1∶1 000)一抗，湿盒，4 ℃过夜；恢复室温，0.01 mol/L PBS浸洗5 min×5次；加入CY3(1∶1 000)及Fitc(1∶500)标记的二抗，湿盒，避光，37 ℃ 120 min；恢复室温，0.01 mol/L PBS浸洗5 min×5次；DAPI复染，湿盒，避光，室温5 min；0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次；防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察并拍照。AQP1、α-tubulin蛋白分别定位于细胞膜及细胞质，镜下选取膝状神经节为目标结构，分别使用红色、绿色通道观察膝状神经节中2种蛋白的荧光强度，将荧光信号通过摄像机转换为数字图像，在计算机上使用Image J软件测算两种荧光的平均荧光强度，代表目的蛋白相对表达量。

1.7统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料比较采用独立t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

两组取材过程中，颅骨硬度适当，颞骨可轻松切下，无砂砾感，切下的颞骨无松散及组织脱落。EDTA组、硝酸组脱钙所需时间分别为(11.20±0.83)d、(26.20±2.38)min，两组相比，P<0.05。

EDTA组甲苯胺蓝染色均一，颞骨整体形态保持完好，蜗管、镫骨肌、岩动脉、神经元、雪旺细胞、郎飞结、神经干可清晰辨识。硝酸组颞骨整体结构保存较理想，神经元形态保持尚可，但存在骨质染色不均、雪旺细胞崩解、轴突肿胀、郎飞结消失现象。详见图1。

EDTA组荧光清晰明亮，背景干净，边缘清楚，AQP1、α-tubulin蛋白定位准确，组织区分度高，硝酸组三种荧光都存在消减，尤其是红色荧光最为严重，绿色荧光晕染，边缘模糊，组织形态保持较差。EDTA组、硝酸组绿色荧光强度分别为30.23±7.32、17.56±6.58，红色荧光强度分别为42.84±8.24、12.85±4.11，蓝色荧光强度分别为35.69±6.58、20.47±5.75，两组相比，P均<0.05。详见图2。

注：A、B、C为EDTA组；D、E、F为硝酸组。

图1两组颞骨脱钙后组织形态观察

注：A、B、C、D分别为EDTA组α-tubulin、AQP1、DAPI及三种荧光Merge后图像；a、b、c、d分别为硝酸组α-tubulin、AQP1、DAPI及三种荧光Merge后图像。

图2两组脱钙后颞骨中α-tubulin、AQP1蛋白定位及表达

3　讨论

骨组织中富含钙盐，硬度较高，直接切片难度较大。目前通行的方法是使用脱钙法将其中的钙盐去除，待骨质变软后进行切片。脱钙技术是目前最常用的骨组织处理方法，主要用于质硬的骨组织或含有骨组织的肿瘤的预处理[3]。脱钙液的选择对于后期制片及诊断具有重要意义。脱钙试剂大致可分为酸性脱钙液(硝酸、盐酸、硫酸、甲酸等)及钙络合剂(EDTA、柠檬酸钠)两种[4～6]。

酸性脱钙液能与钙盐迅速反应，由于所选酸性脱钙液溶剂浓度及骨质质地不同，至脱钙终点所需的时间也存在差异，在数分钟至数小时不等[5，7]。酸性脱钙液中的酸与钙盐反应迅速，可实现快速脱钙，且酸性脱钙液具有配置简单、对反应条件要求不高等优势，能够满足常规病理尤其是快速病理的需求。近年来，酸性脱钙液出现许多改进，如将两种或两种以上的脱钙液进行混合，或化学脱钙和物理方法结合等[8,9]，但其基本化学反应本质并没有发生改变，仍为酸性溶液与钙盐反应。蛋白质及核酸与酸性脱钙液进行化学反应可出现不可逆的变性，可能对后期分子定位及定量评价造成影响；另外，酸与钙盐的反应为分解反应，期间产生的小气泡及热量易造成组织结构变形、破坏，难以做到原位观察[10]。因此，酸性脱钙液的适用范围仅限于普通染色进行大体形态学观察，若进行分子或细胞结构(细胞膜、细胞核)研究，则需要寻找一种对抗原亲和力高且对组织形态影响小的脱钙方法。络合剂能与骨质中的钙离子进行螯合反应，形成可溶的非离子螯合物从而实现脱钙目的。与酸性脱钙液最大的不同之处在于，上述螯合反应在中性条件下进行，过程温和，不产生气泡，对蛋白质亲和性较高[11]。但螯合反应进行缓慢，其最大的缺点在于脱钙周期较长(需两周至一个月)，在脱钙过程中需不断更换脱钙液且每天判断脱钙终点才能获得良好的脱钙效果[12]。

在涉及动物模型的研究中，常常需对蛋白进行原位标记和观察，在处理组织过程中，保持组织形态及抗原完整显得尤为重要。颞骨内骨质不均一，结构精细，包含神经、肌肉、血管等不同质地的组织[13]。脱钙前对颞骨进行取材将不可避免地挤压、震动颞骨，造成其内部结构移位、碎裂，取材也难以做到精确。因此我们在颞骨取材前对大鼠整个头颅骨进行脱钙处理，保证颞骨内结构完整。脱钙前清除颅骨附着的骨膜、肌肉等附属组织，有利于颅骨与脱钙液接触，加快脱钙进程，保证脱钙效果。另外，由于大鼠头颅骨之间结合疏松，骨质较软，清除颅骨附着组织时应避免牵拉和挤压而造成颅骨结构破坏，宜使用锋利的剪刀、刀片小心修剪，避免暴力牵拉。由于EDTA脱钙周期较长，我们在脱钙前使用多聚甲醛对大鼠颅骨进行固定，可进一步保护颞骨内蛋白质，最大限度保存蛋白质的抗原性[14]。我们利用颞骨解剖学特点，选择定位于细胞膜内的AQP1[15]及定位于胞质内的α-tubulin[16]作为目标蛋白，实现对颞骨内不同组织结构蛋白表达的观察。

我们发现，两组取材过程中，颅骨硬度适当，颞骨可轻松切下，无砂砾感，切下的颞骨无松散及组织脱落。EDTA组脱钙所需时间长于硝酸组。EDTA组颞骨整体形态保持完好，蜗管、镫骨肌、岩动脉、神经元、雪旺细胞、郎飞结、神经干可清晰辨识；硝酸组颞骨整体结构保存较理想，神经元形态保持尚可，但存在骨质染色不均、雪旺细胞崩解、轴突肿胀、郎飞结消失现象。EDTA组颞骨脱钙后AQP1、α-tubulin蛋白定位准确，组织区分度高；而硝酸组由于细胞膜中AQP1遭受破坏、位于微管内的α-tubulin蛋白漏出细胞，荧光消减明显，组织形态保持较差。结合上述研究结果，我们认为，10% EDTA和5%硝酸脱钙处理各有优点，对于脱钙液的选择应结合自身实验条件及目的。硝酸脱钙液适用于时间紧张的解剖学研究，对于时间宽松且对图片质量要求较高的实验，不论是形态学还是分子学定位及定量研究，应首选EDTA脱钙液。

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江苏省卫生厅重大项目(H201259)。

李爱民(E-mail: liaimin6529@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.013

R446.6

A

1002-266X(2016)31-0043-03

2016-01-30)