清热解毒化浊片对ETM兔肝组织CD14及TNF-α、IL-1表达的影响

赵国荣*，张衎，何宜荣*，艾碧琛，肖碧跃，贺又舜，左亚杰，熊焰，陈兰玲，尹周安

（1.湖南中医药大学中医学院，湖南长沙410208；2.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

清热解毒化浊片对ETM兔肝组织CD14及TNF-α、IL-1表达的影响

赵国荣1*，张衎2，何宜荣1*，艾碧琛1，肖碧跃1，贺又舜1，左亚杰3，熊焰1，陈兰玲3，尹周安1

（1.湖南中医药大学中医学院，湖南长沙410208；2.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007）

目的探讨清热解毒化浊片对内毒素血症（Endotoxemia，ETM）模型兔肝功能、肝组织CD14和血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）的影响。方法将21只新西兰大耳白兔随机分为正常组、模型组、清热解毒化浊片组（清化组），每组7只。将模型组及清化组兔沿耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素（LPS，10μg/kg），于造模后2 h干预，灌胃后2 h心脏采血检测家兔的肝功能、TNF-α和IL-α的变化，采肝脏组织检测CD14及观察肝脏病理形态。结果（1）与模型组比较，清化组ALT、AST上升（P＜0.05），肝组织CD14表达及血清TNF-α、IL-1下降（P＜0.05）；（2）模型组肝细胞排列结构紊乱，有炎性细胞浸润，且出现空泡样改变，清化组及正常组改变不明显。结论清热解毒化浊片能下调ETM模型兔CDl4、TNF-α和IL-1的表达，具有多靶点、多效应的干预作用，推测其有阻断早期LPS诱导信号通路的作用。

内毒素血症；清热解毒化浊片；CD14；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1；茵陈；黄芩；滑石

Effect of Qingre Jiedu Huazhuo Tablets on Expression of CD14 in Liver Tissue，TNF-αand IL-1 of ETM Rabbits

〔Abstract〕Objective To investigate the effect of Qingre Jiedu Huazhuo（QJH）tablets on the expression of CD14，TNF-αand IL-1 in liver tissue of ETM rabbits.M ethods The 21 New Zealand big-eared rabbits were random ly divided into normal group，model group，QJH tablets group，7 in each group.The ear edge of model group and QJH group was given intravenous injection of 10μg/kg endotoxin.After 2 hours of modeling，the rabbites were given intervention.Then，the liver function，TNF-αand IL-1 were tested.The CD14 in liver tissue was determined and the pathological morphology was observed.Results（1）Compared with the model group，the ALT and AST of QJH tablets group were increased（P＜0.05）.The CD14 expression in liver tissue and serum TNF-αand IL-1 were decreased（P＜0.05）.（2）The liver cell array structure of model group was disorder with inflammatory cells infiltration and a cavity change，but the changes in QJH tablets group and blank group were not obvious.Conclusion Qingre Jiedu Huazhuo tablets with multi-point target and munti-effects can decrease CDl4，TNF-αand IL-1 in ETN rabbits，suggesting the tablets have an effect on the signaling pathway induced by LPS in the early days.

〔Keywords〕endotoxemia；Qingre Jiedu Huazhuo tablets；CD14；TNF-a；IL-1；oriental wormwood；radix scutellariae；talc

研究团队前期对清热解毒化浊片（简称化浊片）进行了大量临床及实验研究，证实其不仅可用于治疗病毒性肝炎肝损伤，还可清除内毒素［1-3］。本实验以内毒素血症（Endotoxemia，ETM）兔为研究对象，观察清热解毒化浊片对家兔肝功能、CD14、TNF-α、IL-1及肝脏病理形态的影响，以期为该药临床运用提供新的实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物普通级新西兰大耳白兔，雌雄不限，体质量1.8-2.5 kg，由长沙市东创实验动物科技服务部提供。动物许可证号：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2药物清热解毒化浊片（湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供，批号：20100908），规格为0.3 g/片，成人一般剂量为10片/次，3次/d，一天剂量为9 g。根据《中医科研设计与统计学》［4］将清热解毒化浊片配制成浓度为0.04 g/mL的药液（下称药液）。兔灌胃量为0.4 g/kg。药液放4℃冰箱保存。

1.1.3主要试剂与仪器（1）试剂大肠杆菌内毒素（Esch erichia coil 0111∶B4，美国Sigma-Aldrich公司，批号：118K4052）、鳌试剂盒（美国ACC北京科德角生物技术有限公司代理，批号：249018）、兔Anti-NF-kBp65（批号：306428）、SABC免疫组化染色试剂盒（兔IgG批号：SA1022）、DAB显色剂试剂盒（批号：AR1022）、抗体稀释液（批号：C-0007）均购自武汉博士德生物工程有限公司。（2）仪器MK3酶标仪，芬兰LABSYSTBA集团；TDZ5-4.0多管架自动平衡离心机，长沙天创仪器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1分组及造模［5］将21只兔随机分为3组，即正常组、模型组、清热解毒化浊片组（简称清化组），每组7只。家兔正常饲养3 d，每天测量肛温3次，取平均值为基础体温，并记录各组家兔的一般情况［5］，第3天开始造模，将模型组、清化组按10μg/kg经耳缘静脉注射内毒素，正常组注入同体积无菌生理盐水。

1.2.2药物干预及标本采集根据前期实验［6-7］，造模后至2 h每20分钟测量体温1次，并记录开始发热时间，兔在2 h内，体温升高，心率、呼吸增快，耸毛、发抖、喷嚏。造模2 h时，清化组用清热解毒化浊片药液10 mL/kg灌胃1次；正常组与模型组分别以10 mL/kg温开水灌胃1次。灌胃后同样每20分钟测1次体温，并记录各组兔症状、体征。

灌胃后2 h，清化组体温下降，心率、呼吸恢复正常，耸毛、发抖、喷嚏等消失，但与之相对应的模型组体温仍在升高，心率、呼吸恢复加快，耸毛、发抖、喷嚏等症仍存，此时对正常组、模型组、清化组兔进行心脏采血，每只兔分别用肝素钠抗凝管两支各取血3 mL用于检测肝功能、TNF-α、IL-1。取血完毕后，从耳缘静脉注入乌拉坦3 mL/kg，在麻醉状态下取肝脏右下叶组织，备做病理形态、免疫组化检测CD14。

1.3检测指标及方法

1.3.1肝功能测定由湖南中医药大学第一附属医院检验科测定。

1.3.2TNF-α、IL-1检测将各组血清标本，按照试剂盒说明书进行TNF-α、IL-1检测。

1.3.3免疫组化检测CD14将切片脱蜡至水。按照盒试剂盒说明书进行相关操作。最后苏木精复染2 min，盐酸酒精分化后自来水冲洗10-15 min，脱水、透明、封片、400倍光学显微镜下观察拍片。用Image-Pro Plus 6.0软件分析得出CD14的平均光密度值。

1.3.4肝细胞HE染色取肝脏右叶组织，以4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋切片，然后使用平推式切片机连续切片，切片载入载玻片后予行HE染色，染色时间为10 min左右，切片厚度约5μm，400倍光学显微镜下随机选取3个视野观察拍片。

1.4统计学处理

实验数据以SPSS 16.0统计软件进行统计分析。全部计量资料以“±s”表示，首先进行正态性、方差齐性检验。满足正态性者，不同组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），并进行组间的多重比较；方差齐时选择LSD法，方差不齐时选择Dunnett T3法；不满足正态性时选择秩和检验。以P＜0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1清热解毒化浊片对家兔内毒素血症肝功能的影响

造模后，模型组与正常组比较，模型组ALT、AST均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，清化组与模型组比较，清化组ALT、AST均上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。

表1　清热解毒化浊片对肝功能的影响（±s，n=7，U/L）

表1　清热解毒化浊片对肝功能的影响（±s，n=7，U/L）

注：与正常组比，△P＜0.05；与模型组比，▽P＜0.05。

组别ALT AST正常组55.2±3.49 50.3±4.25模型组49.6±4.83△45.2±3.82△清化组56.7±1.2▽49.6±2.1▽

2.2清热解毒化浊片对家兔内毒素血症肝脏组织CD14及血清细胞因子的影响

造模后，模型组与正常组比较，模型组肝脏组织CD14、血清TNF-α、IL-1水平均上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；经过治疗后，清化组与模型组比较，清化组肝脏组织CD14、血清TNF-α、IL-1水平均下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2。

从免疫组化图中可见，正常组肝脏没有CD14阳性表达（图1-A），模型组周围肝血窦及肝细胞有CD14阳性大量表达（图1-B）；清化组有少量CD14阳性表达（图1-C）。

表2　清热解毒化浊片对肝脏组织CD14以及血清TNF-α、IL-1的影响（±s，n=7）

表2　清热解毒化浊片对肝脏组织CD14以及血清TNF-α、IL-1的影响（±s，n=7）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

组别CD14 TNF-α（ng/L）IL-1（ng/L）正常组1.17±0.29 56.7±8.4 4.40±0.96模型组2.56±0.22△75.8±16.3△9.94±2.40△清化组1.28±0.41▲58.7±7.0▲5.30±1.01▲

图1　肝脏组织CD14表达光镜图（免疫组化×400）

2.3清热解毒化浊片对家兔ETM肝损伤肝脏病理形态学的影响

正常组肝组织结构正常，未见变性、坏死炎细胞浸润（图2-A）；模型组肝细胞排列结构紊乱，有炎性细胞浸润，且肝细胞出现空泡样改变（图2-B）；清化组炎细胞浸润、肝细胞肿大及空泡样变性不明显（图2-C）。

图2　肝脏病理形态学光镜图（HE×400）

3　结论

LPS进入机体刺激并促发细胞上TLR4信号通路CDl4等表达引起细胞内信号传递，编码一系列炎症因子，释放TNF-α、IL-1等炎症介质。本实验中清化组的CDl4、TNF-α、IL-1较模型对照组明显降低，且有显著性差异，与正常组比较无显著性差异，说明清热解毒化浊片可以下调CDl4的表达，减少LPS的识别及跨膜信号转导，从而使促炎因子TNF-α的表达减少，可避免后续细胞因子的瀑布式释放及抗炎/促炎失衡。清化组下游促炎因子IL-1的合成减少，也证实清热解毒化浊片对信号通路中CDl4、TNF-α、IL-1起到调控作用。

肝脏作为人体内唯一代谢内毒素的器官，内毒素及各种炎症介质直接或间接造成肝功能损伤，而出现肝功能改变，但因为此实验为急性试验，攻毒时间不长，故肝功能损伤不是很重。但从肝脏病理形态上发现其损伤还是较重，病理形态图片显示：模型组肝细胞排列结构紊乱，有炎性细胞浸润，且肝细胞出现空泡样改变。经过清热解毒化浊片治疗后清化组炎细胞浸润、肝细胞肿大及空泡样变性不明显。实验结果还显示，在内毒素血症早期使用清热解毒化浊片干预后，内毒素水平下降，肝细胞ALT、AST升高恢复活性，血浆内毒素及肝脏组织结构受损呈平行关系。由于清热解毒化浊片可使CDl4表达下调，从而减少前炎症细胞因子生成与释放，内皮细胞激活受限，致使白细胞浸润和微血栓不能形成及炎症反应进一步放大被阻断；清化组TNF-α、IL-1下降，ALT、AST活性恢复升高。因此清热解毒化浊片治疗内毒素血症肝损伤调控TLR4信号通路是多靶点的整体调节。

在前期的实验研究中，无论是急性、慢性肝病，基本病机为“湿、热、毒、浊”［2］。因此有人研究发现温病卫、气、营、血阶段中均存在内毒素血症［7］，并且与温病卫气营血辨证具有相关性［6］，故本研究攻毒后2 h相当于卫分证阶段，在该时期初期使用清热解毒，化浊利湿之法，以达到驱邪外出并促进机体自身免疫功能恢复的目的。清热解毒化浊片中有茵陈、滑石、黄芩三药清热利湿；石菖蒲、藿香辟秽和中，宣湿浊之壅滞；白蔻仁芳香悦脾，令气畅而湿行；木通清利湿热，导湿热从小便而去；连翘、贝母清热解毒、散结消肿。诸药合用，重在清热利湿，使湿邪得去，热毒得清，气机调畅。

［1］赵国荣，曹军连，谢静，等.不同剂量清热解毒化浊片对大鼠免疫性肝损伤治疗作用的对比研究［J］.中西医结合肝病杂志，2004，l4（1）：23-25.

［2］谢静，赵国荣，熊焰，等.清热解毒化浊片对慢性病毒性肝炎湿热内蕴证、肝郁脾虚证疗效的研究［J］.湖南中医学院学报，2003，23（6）：33-35.

［3］肖碧跃，越国荣，艾碧琛，等.清热解毒化浊片对病毒性肝炎肝损害疗效观察［J］.湖南中医药大学学报，2010，30（7）：49-50.

［4］贺石林，王建，王净净.中医科研设计与统计学［M］.长沙：湖南科学技术出版社，2003：20-21.

［5］艾碧琛，赵国荣，贺又舜，等.探讨内毒素血症兔复制卫气营血可能性的实验体会［J］.中医药信息，2011，28（5）：23-25.

［6］赵国荣，艾碧琛，贺又舜，等.内毒素血症兔症状、体征动态变化与卫气营血传变的相关性［J］.中医杂志，2011，52（15）：1305-1307.

［7］杨爱东，曾兰，屠燕捷，等.不同治法对内毒素血症小鼠肺组织细胞因子的影响［J］.辽宁中医杂志，2007，34（3）：358-360.

（本文编辑杨瑛）

ZHAO Guorong1*，ZHANG Kan2，HE Yirong1*，AI bichen1，XIAO Biyue1，HE Youshun1，ZUO Yajie3，XIONG Yan1，Chen Lanling3，YIN Zhouan1
（1.College of TCM，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2．The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530023，China；3.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.09.006

2015-12-06

湖南省教育厅重点项目资助（12A101）；湖南中医药大学中医临床基础重点学科资助；湖南中医药大学校级青年基金（校行科字［2013］4号）资助。

*赵国荣，女，二级教授，主任医师，E-mail：zhaoguorong1116@sina.com；何宜荣，男，讲师，主治医师，E-mail：260124907@qq.com。