柴芍乳癖颗粒对乳腺增生兔模型B超声像及组织形态学的影响

杨春萍，刘丽芳*，杨涛，聂佳欣，高双双，胡文文

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；3.湖南省第二人民医院，湖南长沙410007）

柴芍乳癖颗粒对乳腺增生兔模型B超声像及组织形态学的影响

杨春萍1，刘丽芳2*，杨涛1，聂佳欣1，高双双1，胡文文3

（1.湖南中医药大学，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；3.湖南省第二人民医院，湖南长沙410007）

目的观察柴芍乳癖颗粒对乳腺增生病兔模型乳腺组织B超声像及组织形态学的影响。方法56只健康未孕新西兰雌兔，随机挑出10只为正常对照组，肌注生理盐水；46只为模型制备组，序贯肌注雌孕激素造模。2组均随机处死1只雌兔，观察病理切片确定造模成功后，将模型制备组剩下的45只兔再随机分为5组：模型对照组、乳癖散结颗粒组、柴芍乳癖颗粒低、中、高剂量组。6组兔每天分别予以生理盐水、乳癖散结颗粒（0.56 g/kg）、柴芍乳癖颗粒（0.47、0.94、1.88 g/kg）水溶液灌胃1次，连续3月。末次灌胃24 h后麻醉，用B超机采集第2对乳房的声像图，处死后取第2对乳腺组织，HE染色观察组织形态学表现，计数乳腺小叶腺泡数、导管上皮细胞层数、腺泡腔直径。结果柴芍乳癖颗粒能使模型兔乳腺组织低回声区缩小，内部回声强度减低，其中高剂量组最明显；与模型组相比，柴芍乳癖颗粒低、中、高剂量跟乳癖散结颗粒均可明显缩小腺泡腔直径（P＜0.01），中、高剂量可以减少乳腺导管上皮细胞层数，低剂量还可减少乳腺小叶腺泡数（P＜0.05）。结论柴芍乳癖颗粒可以改善乳腺增生兔模型B超声像，减轻雌兔乳腺增生程度，治疗乳腺增生效果明显。

乳腺增生；柴芍乳癖颗粒；B超声像；组织形态学；柴胡

〔Abstract〕Objective To observe the effect of Chaishao Rupi Granules on B type ultrasound images and histomorphology of rabbit models with breast hyperplasia.M ethods 10 rabbits were random ly selected from 56 healthy unfertilized female New Zealand rabbits as the normal control group，which were given muscle injection with normal saline，46 rabbits as model preparation group，which were taken female progestogen sequential muscle injection.Random ly killing female rats in the two groups，determine the model is successful or not by observing the pathological section.The remaining 45 rabbits in model preparation group were divided into 5 groups：model control group，Rupi Sanjie granule group，and low dose，middle dose，high dose of Chaishao Rupi granules groups.The six groups were administrated normal saline，0.56 g/kg Rupi Sanjie granules，and 0.47 g/kg，0.94 g/kg，1.88 g/kg Chaishao Rupi granules，respectively，once a day，continuous for 3 months.At 24 h after the last lavage，we implemented the anesthesia to all of the rabbits and collected the second pair of breasts'B ultrasound images. We cut the second pair of breast tissue out.The histomorphology after HE staining was observed.The numbers of lobular acini，duct epithelial layer and acinus cavity diameter were counted.Results Chaishao Rupi granules can shrink the rabbit model's breast tissue keyed acoustic area，decrease internal echo intensity，the effect of high dose group is the most obvious.Compared with model group，three doses of Chaihu Rupi granules and Rupi Sanjie granules can narrow the acinus cavity diameter significantly（P＜0.01）.The middle dose and high dose can reduce the mammary ductal epithelial cell layers（P＜0.05），low dose can also reduce lobular acini number（P＜0.05）.Conclusion Chaishao Rupi granules can improve B ultrasonicimage of mammary gland hyperplasia rabbit models，can reduce the degree of female rabbits'hyperplasia of mammary glands. The effect on hyperplasia of mammary glands is obvious.

〔Keywords〕hyperplasia of mammary glands；Chaishao Rupi granules；B type ultrasound images；histomorphology

乳腺增生病（hyperplasia of mammary glands，HMG）是乳腺组织的一种既非炎症也非肿瘤性病变。据调查，70%～80%的女性都有不同程度的乳腺增生［1］。HMG是最常见的乳房疾病［2］，且有癌变可能。终末导管小叶单位→普通增生→非典型增生→原位癌→浸润性癌→转移癌是连续演变的，但在出现“原位癌”之前上述进程是可逆的。积极治疗乳腺增生，既能解除广大患者的痛苦，又能避免发展为乳腺癌。

导师刘丽芳教授根据多年临床经验创制出柴芍乳癖汤，已经在临床上采用中药配方颗粒的形式运用多年。经前期临床观察表明：柴芍乳癖汤能在一定程度上控制乳腺增生症状［3］。但目前尚无柴芍乳癖颗粒对乳腺组织产生影响的直观证据。本次动物实验通过创建兔HMG模型，观察兔乳腺组织的B超声像及组织形态学表现，以期直观验证柴芍乳癖颗粒对HMG的疗效。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物健康未孕雌性新西兰白兔56只，体质量1.7～2.5 kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供，使用许可证编号：SYXK（湘）2013-0005。

1.1.2药物柴芍乳癖颗粒（简称CSRPKL）：柴胡、白芍、当归、青皮、郁金、瓜蒌皮、浙贝母、莪术、橘核、牡蛎、夏枯草、王不留行、白术、茯苓（一方中药配方颗粒），由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供；乳癖散结颗粒（简称RPSJKL）：陕西白鹿制药股份有限公司，4 g/袋，批号150503。

1.1.3主要试剂苯甲酸雌二醇注射液（宁波第二激素厂，批号140910）、黄体酮注射液（浙江仙琚制药股份有限公司，批号140706）、0.9%氯化钠注射液（湖南科伦制药有限公司，批号G141201F）、8%硫化钠水溶液、10%甲醛溶液、巴比妥钠等分析纯试剂。

1.1.4主要仪器尼康CI-1研究型正置荧光显微镜；Motic BA410研究型显微镜（加拿大麦克奥迪）；Motic 6.0数码医学图像分析系统（加拿大麦克奥迪）；M5迈瑞便携式彩色B超机（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；莱卡RM2235轮转石蜡切片机；金迪YD-A生物组织摊片机；DNP-9162电热恒温培养箱（上海一恒）。

1.2方法

1.2.1HMG模型兔的创建56只兔编号1-56，抓阄法随机挑出10只为正常对照组编号Z1-Z10、剩余46只为模型制备组，编号M1-M46，参考文献［4］造模方法，正常对照组双大腿内外侧肌肉丰厚处交替肌注生理盐水，1次/d，连续30 d；模型制备组肌注（兽用）苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg，1次/d，连续25 d，随后肌注（人用）黄体酮1 mg/kg，隔天1次，共3次。末次肌注24 h后将兔腹部脱毛观察乳房大体变化情况，两组均随机挑出1只兔处死，取第2对乳房做病理切片，显微镜下观察乳腺组织形态，确认造模成功。

1.2.2分组与给药将造模后的45只雌兔，按体质量由低到高编号1-45，用随机数字表法随机编入模型对照组、RPSJKL组和CSRPKL低、中、高剂量组5个组，加上正常对照组，共6个组，每组9只。采用灌胃给药，1次/d，连续3月。按照徐叔云［5］《药理实验方法学》体表面积法换算，CSRPKL中剂量组和RPSJKL组换算为临床日用量等效剂量，低、中、高剂量组按1∶2∶4的比例用药。每只兔每日灌胃药量分别为RPSJKL组0.56 g/kg、CSRPKL低剂量组0.47 g/kg、中剂量组0.94 g/kg、高剂量组1.88 g/kg。正常对照组、模型对照组兔灌同体积的生理盐水。

1.2.3B超声像采集及病理取材造模后及末次灌胃后24 h，用5%巴比妥钠200 mg/kg腹腔注射麻醉，仰面固定在解剖台上，先剪短腹部（锁骨→腹股沟）被毛，再均匀涂抹8%硫化钠水溶液，几分钟后待被毛变成黄色粘稠液态物质，抹布蘸温水擦净，观察乳房大体变化，标号拍照。末次灌胃标号拍照后，用便携式彩超机采集第2对乳房的B超声像图，然后空气栓塞致死，剪取第2对乳房。

1.2.4病理切片的制作与染色（1）固定：将离体组织标本在10%甲醛溶液中浸泡24 h以上；（2）脱水、透明、石蜡包埋；（3）切片：蜡块连续切片，厚约4μm；（4）HE染色：①二甲苯连续脱蜡2次，10 min/次；②梯度酒精复水，2～5 min/次；③苏木素染色，5～10 min；④水洗时间随机；⑤蓝化时间随机；⑥伊红液染色，1～3 min；⑦梯度酒精脱水，2～5 min/次；⑧二甲苯两步透明；（5）中性树脂封片，标号及标示左右。

1.2.5组织形态学观测用Motic BA410研究型显微镜在10×10倍光镜下观察经HE染色后的病理切片，用Motic 6.0数码医学图像分析系统采集图像，每只兔观测左、右二张切片，每张切片观测4个视野，计数每个视野中乳腺小叶腺泡数、腺泡腔直径和导管上皮细胞层数，取4个视野的平均值作为该切片的数值，取左、右二张切片的平均值作为该只兔的最终值。

1.3统计学处理

2　结果

2.1造模后乳房大体变化

末次肌注激素24 h后将兔腹部脱毛，观察见：两组雌兔各乳头均充血增大，其中第2对最明显（正常对照组见图1A，模型制备组见图1B）。

图1　兔腹部4对乳房大体照片

2.2HMG兔模型的评价

显微镜下观察处死的正常对照组和模型制备组雌兔的乳腺组织病理切片，可见正常乳腺组织（图2A）小叶腺胞数较少，导管上皮细胞排列整齐，导管腔基本无扩张。模型制备组（图2B）乳腺小叶腺泡数增加，导管上皮细胞层数增加、结构紊乱，腺泡腔明显扩张，腔内可见脱落的上皮细胞及分泌物，参考文献［6］标准，可以判定造模成功。

2.3干预后乳房B超声像表现

正常对照组（图3A）乳腺腺体层不增厚，模型对照组（图3B）乳腺腺体增厚，回声强弱不一，内部光点增粗，回声区形状近似介于椭圆形和梭形之间，药物干预后，RPSJKL组（图3C）和CSRPKL低剂量组（图3D）乳腺组织稍厚，低回声区呈长条形，其中RPSJKL组的面积小于低剂量组；中剂量组（图3E）乳腺组织类似半椭圆形，中央回声稍高；高剂量组（图3F）乳腺组织低回声区比RPSJKL组和低剂量组窄、厚，边界较模糊，形态略不规整。

图2　兔第2对乳腺组织病理切片光镜图（HE×100）

图3　兔乳房B超声图像

2.4干预后兔乳腺组织病理形态学情况

由于实验正值梅雨季及酷夏，动物饲养环境一般，加之实验人员操作不熟练、动物不配合等原因，灌胃3月后仅剩44只雌兔。其中，模型对照组1只兔因奋力反抗肌注、灌胃等操作而双下肢瘫痪，1只被野鼠咬伤感染而亡；CSRPKL低剂量组因药液灌至肺内死亡2只，腹泻死亡1只；中剂量组死亡2只，高剂量组死亡3只，解剖见肺内有药液残留、胸腔大量炎性积液。6组雌兔第2对乳腺组织病理切片详见图4。

图4　兔乳腺组织病理切片光镜图（HE×100）

与正常对照组相比，模型对照组乳腺小叶腺泡数、导管上皮细胞层数增多（P＜0.05），腺泡腔直径显著扩张（P＜0.01），造模效果好。干预后，与模型组相比，CSRPKL低剂量组乳腺小叶腺泡数减少（P＜0.05），CSRPKL中、高剂量组导管上皮细胞层数减少（P＜0.05），RPSJKL组及CSRPKL低、中、高剂量组腺泡腔直径均明显缩小（P＜0.01）。结果见表1。

表1　各组乳腺小叶腺泡数、导管上皮细胞层数、腺泡腔直径比较（±s）

表1　各组乳腺小叶腺泡数、导管上皮细胞层数、腺泡腔直径比较（±s）

注：与正常对照组相比，●P＜0.05，●●P＜0.01；与模型对照组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别n正常对照组模型对照组RPSJKL对照组CSRPKL低剂量组CSRPKL中剂量组CSRPKL高剂量组9 7 9 6 7 6乳腺小叶腺泡数（个）4.58±3.65 10.42±4.27●6.90±2.50 4.75±2.26▲6.92±3.37 5.83±2.76导管上皮细胞层数（层）1.07±0.65 2.25±0.45●1.83±0.39 1.65±0.45 1.43±0.49▲1.43±0.49▲腺泡腔直径（μm）56.73±12.80 108.85±24.88●●79.04±23.04▲▲73.81±19.78▲▲67.48±13.50▲▲73.07±16.74▲▲

3　分析与讨论

HMG主要病因为内分泌失调，属慢性疾病。目前，诊断HMG的首选检查方法是B超［7］，无创、可反复使用；确诊HMG的方法是病理检查，但有创，患者不易接受。常用治疗HMG的西药有激素类、维生素类、碘制剂、利尿消肿药和止痛剂。激素类药物会加重机体内分泌失调，停药后乳房疼痛加重，出现子宫内膜增厚甚至癌变、月经不调等副反应；碘制剂有导致甲状腺功能障碍的风险；维生素类没有直接抗增生作用，疗效不确切；利尿消肿药和止痛剂也是“治标不治本”。而据统计，中医药治疗HMG的平均有效率为（93.50±6.45）%［8］，能有效控制HMG的临床症状，副反应也较少。因此，对临床疗效显著的柴芍乳癖颗粒开展相关研究具有较高价值和重要意义。

HMG以乳房疼痛和肿块为主要临床表现，属中医学“乳癖”范畴，由郁怒伤肝、思虑伤脾、气滞血瘀、痰凝成核，气、血、痰三者夹杂同时致病［9］。柴芍乳癖颗粒由14味中药组成，针对乳癖的病因病机，方中君药柴胡疏肝解郁，白芍养血敛阴、柔肝止痛；臣药青皮疏肝破气、消积化滞，郁金活血止痛、行气解郁，白术和茯苓益气健脾、利水渗湿，当归活血补血，佐药瓜蒌皮、浙贝母和橘核清热化痰、理气宽胸、散结止痛，使药川楝子行气止痛，王不留行活血通经，莪术破血行气、消积止痛，丹参活血祛瘀止痛，牡蛎软坚散结，夏枯草清肝泻火、散结消肿。诸药合用，共奏疏肝理气、健脾益气、除湿化痰、活血化瘀、散结止痛之功。

本研究通过创建模拟人类HMG的兔模型，进行长期药物干预实验，既能减轻患者的痛苦，又能减少患者依从性不高对实验结果的影响。通过研究发现：在B超声像方面，柴芍乳癖颗粒能缩小增生乳腺组织回声区范围，降低乳腺组织内部回声强度。在乳腺组织病理形态学方面，柴芍乳癖颗粒减轻增生的作用是值得肯定的，低剂量组能减少乳腺小叶腺泡数，中、高剂量组可以减少导管上皮细胞层数，低、中、高剂量组均能明显缩小腺泡腔直径。但与正常对照组相比，各用药组均未恢复至乳腺无增生状态，可能与中药起效慢有关。另外，从乳房大体照片上可以看出：实验中正常对照组雌兔乳头亦充血增大，可能与兔龄增长自然发育有关，属正常生理现象，病理切片显示兔乳头充血增大与乳腺组织增生无必然联系。

目前，中医药治疗HMG的动物实验多采用小鼠、大鼠造模，采用兔的很少，而且已查阅到的文献内建立HMG动物模型的部分激素已经停产。因此，本实验参考前人研究成果，创新性采用兽用激素注射液进行造模，并在激素使用剂量和次数上进行探索。实验发现：肌注（兽用）苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，1次/d，连续25 d，随后肌注（人用）黄体酮注射液1 mg/kg，隔天1次，共3次，可创建出HMG兔模型。病理观测造模效果好，希望对后续研究者起到一定的参考作用。本文的造模方法前期仅进行过1次预实验，模型的重复性和稳定性有待后续研究者进一步实验后评判。

［1］张保宁.乳腺肿瘤学［M］.北京：人民卫生出版社，2013：453.

［2］徐春红.乳腺增生病的流行病学综述［J］.北方药学，2013，12：92-93.

［3］王月，刘丽芳.柴芍乳癖汤治疗乳腺增生病疗效观察［J］.广西中医药，2012，1：14-15.

［4］陈晰，秦优优，张建国，等.消乳散结胶囊治疗兔乳腺增生的实验研究［J］.现代生物医学进展，2012，12（32）：6249-6252，6281.

［5］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2002：1861.

［6］陈静，李渤文，孟宪波，等.消癖颗粒对家兔乳腺增生模型的影响［J］.齐鲁药事，2007，26（7）：427-428.

［7］李晓曦.乳腺增生症的诊断［J］.临床外科杂志，2007，15（6）：374-375.

［8］刘晓雁，刘鹏熙，李广曦.乳腺增生症的中医辨证用药规律分析［J］.江苏中医药，2007，39（6）：53.

［9］刘靖，靳小磊，耿刚.乳腺增生病发病因素的分析［J］.内蒙古中医学，2010，29（5）：121-123.

（本文编辑杨瑛）

Effects of Chaishao Rupi Granules on B Type Ultrasound Images and Histomorphology of Rabbit M odels w ith Breast Hyperp lasia

YANG Chunping1，LIU Lifang2*，YANG Tao1，NIE Jiaxin1，GAO Shuangshuang1，HU Wenwen3
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China；3.Hunan Second People's Hospital，Changsha，Hunan 410007，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.09.007

2015-12-06

杨春萍，女，硕士，研究方向：中医外治法。

〔通迅作者〕*刘丽芳，女，教授，主任医师，博士研究生导师，E-mail：liulff@126.com。