黄姜色素的抗氧化活性研究

高　蓉,杨鑫磊,骆军容,李稳宏

(1.中国人民解放军第451医院, 陕西 西安　710054;2.西北大学 化工学院,陕西 西安　710069;3.第四军医大学 校务部， 陕西 西安　710032)



·化学与化学工程·

黄姜色素的抗氧化活性研究

高蓉1,杨鑫磊2,骆军容3,李稳宏2

(1.中国人民解放军第451医院, 陕西 西安710054;2.西北大学 化工学院,陕西 西安710069;3.第四军医大学 校务部， 陕西 西安710032)

以黄姜为原料,提取其中色素成分,以2,6-二叔丁基对苯酚(BHT)为对照,考察了黄姜色素成分对超氧物阴离子自由基(O2·-)、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力、抗脂质过氧化能力及还原能力。结果显示,黄姜色素对超氧物阴离子自由基(O2·-)的清除活性略低于BHT(IC50值为0.392mg/mL);对DPPH的清除活性(IC50值为0.334mg/mL)和对ABTS的清除活性(IC50值为0.123mg/mL)均高于BHT;在实验浓度内,黄姜色素表现出了较好的抑制脂质过氧化能力(IC50值为0.258mg/mL);此外,通过普鲁士蓝法测得色素的还原能力与BHT相当。由此可知,黄姜色素具有一定的抗氧化活性,是良好的天然抗氧化剂,可望被发展成为一种功能性食品添加剂及生物药品基料。

黄姜色素;抗氧化活性;抗氧化剂

机体内因为活性氧而引发、生成的自由基,能够同细胞内包括脂质、蛋白质、糖类、DNA等多数生物分子发生氧化反应,损伤机体内各组织器官,导致机体加速衰老并引发诸如动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等相关疾病,近年来,天然抗氧化活性物质的研究与开发,已经成为了国内外研究的一个热点[1-2]。黄姜是薯蓣科多年生草质缠绕性藤本植物盾叶薯蓣的根茎,主要含有薯蓣皂苷类、淀粉、单宁及色素等化学成分[3-5]。目前对黄姜的研究主要集中在甾体皂素、淀粉及下游相关激素类药物合成开发等[6-8]方面,对黄姜色素的相关研究报道较少。

黄姜色素的主要成分为类胡萝卜素类物质,属天然色素之列[9]。类胡萝卜素具有较高的抗氧化能力,在预防癌症、强化免疫系统等方面起到重要作用[10-11]。基于此,本研究以黄姜中的色素成分为研究对象,测定和分析其抗氧化活性,以期为开发利用黄姜资源提供一定的科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

黄姜(采自汉中市城固县),使用前切片、烘干并粉碎,0.2mm筛分,低温避光保存。

DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)、ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐),美国Sigma公司;Trolox(水溶性维生素E),MP Biomedicals公司;BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚),天津市光复科技发展有限公司;SD大鼠3只,由西安交通大学医学部动物实验中心提供,动物许可证号:SCXK 2012-003;无水硫酸钠、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、邻苯三酚,丙酮、乙醇、环己烷、甲醇等试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

UV-2550型紫外-可见分光光度计,日本岛津公司;AB204-S型分析天平,梅特勒-托利多国际股份有限公司;SC-3610低速离心机,科大创新股份有限公司中佳分公司;Neofuge型冷冻离心机,上海申力科学仪器有限公司。

2　实验方法

2.1黄姜色素的提取

准确称取30.0g黄姜粉末,放入500mL的烧杯,加入70%(质量分数)乙醇溶液300mL,70℃恒温水浴2h,浸提2次。提取液抽滤,减压浓缩,无水硫酸钠干燥,挥干溶剂得到色素粗提取物。取0.5g色素粗提取物,溶于2mL环己烷中,加入1.0g活化后硅胶,搅拌均匀,挥干溶剂,干法上样。装柱方法:取120℃活化2h的氧化镁与硅藻土各10g,减压干法装柱,用2BV环已烷淋洗,以丙酮为洗脱剂,将不经硫酸显色即有颜色的洗出液收集在一起,干燥后即为色素提取物。分别精确称取一定量的色素提取物及BHT溶液,用甲醇定容到质量浓度为0.1～0.5mg/mL,作为测试溶液与对照溶液。

经本实验前期研究[9],使用上述方法黄姜色素的一次提取率在10%以上,其中β-胡萝卜素的质量分数约为0.1604‰。

2.2自由基清除率的测定

2.2.1对超氧物阴离子自由基(O2·)的清除采用邻苯三酚自氧化法[12],分别准确移取50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)4.5mL于试管中,依次加入3.2mL甲醇、1.0mL不同浓度的色素溶液与BHT溶液,混匀后置于25℃水浴中,避光静置20min。之后立即加入25℃预热200mmol/L的邻苯三酚溶液0.3mL,混匀后于320nm波长处测定吸光度,每30s记录1次,得8组吸光度值。计算混合溶液的吸光度值随时间的变化率,记为ΔAi。空白对照以甲醇代替色素溶液,测定ΔA0。根据公式(1)计算O2·-的清除率:

(1)

2.2.2对DPPH的清除

1)标准曲线的绘制

精确称取5.0 mg DPPH置于100 mL棕色容量瓶,甲醇定容,配置成50 mg/L的DPPH母液;分别精密量取DPPH母液1～6 mL置于10 mL棕色容量瓶中,甲醇定容,配置成浓度为5～30 mg/L的DPPH标准溶液,在515 nm波长处[13]测定吸光度。以DPPH溶液的质量浓度Ci为横坐标,吸光度值Ai为纵坐标,绘制DPPH标准曲线,拟合方程为:A=-0.026 1+0.024 5C,R2=0.999 8。

2)黄姜色素对DPPH自由基的清除作用

取25 mg/L DPPH甲醇溶液3 mL于棕色样品瓶中,加入1mL不同浓度的色素溶液与BHT溶液,混匀后立即在515 nm波长处测定吸光度,并记录2，3，5，7，10 min时的吸光度值,之后每隔5 min记录一次,直到吸光度变化相差小于0.001时结束。最终测得的吸光度Ai在DPPH标准曲线上所对应的DPPH的残留含量Ci,根据公式(2)计算DPPH被抑制后的残留率:

残留率/%=(1-Ci/Co)×100%。

(2)

2.2.3对ABTS的清除

1)标准曲线的绘制

准确量取3.9 mL ABTS待测液(0.096 0gABTS标准品、2.45 mmol/L过硫酸钾溶液25 mL,用10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)将混合溶液稀释至734 nm波长处[14]的吸光度为0.700±0.020)置于棕色样品瓶中,依次向其中加入浓度为5～25 mg/L Trolox 标准溶液0.1 mL,充分振荡后,静置10 min,在 734 nm波长处[15]测定吸光度。以Trolox 标准溶液的浓度Ci为横坐标,以Trolox 溶液的清除率Yi为纵坐标,绘制标准曲线。在质量浓度为5～45 mg/L范围内,Trolox对ABTS·+清除率的线性方程为:Y=2.301 1+1.638 8C,R2=0.999 2。

2)黄姜色素对ABTS自由基的清除作用

用不同浓度的色素溶液与BHT溶液代替Trolox 标准溶液,重复上述(1)中的实验方法测得溶液的吸光度。计算TC40=0.384 mg/mL,说明Trolox对ABTS·+的清除作用强于色素。并根据公式(3)计算ABTS·+的清除率:

清除率/%=(1-Ai/0.701)×100%。

(3)

2.3黄姜色素抗脂质过氧化作用

2.3.1大鼠肝微粒体悬液的制备将SD 大鼠处死后立即拿出肝脏,清洗干净后称重,用含蔗糖0.01 mol/L 的Tris-HCl缓冲液(0.15 mol/L,pH=7.4)在冰浴条件下,制备肝匀浆液,匀浆液在4 ℃下,2 000 r/min离心10 min,共离心2次,吸去上清液,得到的沉淀就是大鼠的肝脏微粒体。将其置于-20℃下保存。大鼠肝脏微粒体的蛋白浓度按照Lowry 法来测定[14]。

2.3.2大鼠肝微粒体脂质过氧化抑制作用参照文献[15],移取0.5 mL大鼠肝微粒体于一定量的pH为7.5 的磷酸钾缓冲液中,使其蛋白的终浓度大约是0.3～0.5 g/L,在37℃的条件下,振荡孵育完成后,加入0.5 mL,0.1 mmol/L 的Fe2+/VC启动反应。样品组分别加入0.2 mL不同浓度的色素溶液,1h 后,加入1 mL 的10%三氯醋酸溶液终止反应,再加入1.5 mL的 0.67%硫代巴比妥酸溶液在沸水浴下加热30 min后,自然冷却至室温,离心后取上清液在532 nm 处测其吸光度值。

以不加启动剂的试样作为空白组,以不加色素溶液的试样作为阳性对照组。分别测定各浓度下待测试剂组的吸光度值,按照公式(1-4)计算黄姜色素对大鼠肝微粒体脂质过氧化体的抑制率。

抑制率/%=[1-(A样品-A空白)/(A对照-A空白)]×100%。

(4)

2.4黄姜色素的还原力

分别量取不同浓度的黄姜色素溶液、BHT溶液各2 mL,依次加入0.2 mol/L(pH=6.6)磷酸盐缓冲溶液2.5 mL，1%铁氰化钾溶液2.5 mL,混匀后置于50℃水浴中反应20 min,取出自然冷却至室温。之后,向试管中加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL,混匀后4 000 r/min离心10 min,取2.5 mL上清液于另一组试管中,向其中依次加入蒸馏水2.5 mL与0.1%三氯化铁溶液1 mL,混匀后静置10 min,于700 nm波长处测其吸光度。

3　结果与分析

3.1清除超氧物阴离子自由基(O2·)

O2·-由邻苯三酚在弱碱性条件下自氧化产生,抗氧化剂通过抑制自氧化的速率起到对O2·-的清除作用,O2·-清除率的高低与溶液中抗氧化物质与之结合并生成有色中间产物的速率快慢有关。图1是不同浓度下黄姜色素对O2·-的清除率柱状图。

图1　黄姜色素对O2·的清除Fig.1　Scavenging rates of pigment extracts from yellow ginger on O2·

由图1可知,在实验浓度范围内,黄姜色素与BHT对O2·-的清除率随浓度的增加而增大,之后清除速率增加缓慢,这可能是因为反应体系中产生的O2·-浓度越来越小。色素溶液在最大浓度时对O2·-的清除率为48.394%,未到半数清除率;根据清除率随浓度变化的多项式规律,可得到BHT的IC50=0.392 mg/mL。结果表明,黄姜色素对O2·-的清除能力不及BHT。

3.2清除DPPH

DPPH·由DPPH溶解于有机溶剂中自动生成,其溶液为紫色。抗氧化剂通过与DPPH·的单电子结合,使其自由基减少,通过溶液颜色变化显示对DPPH·的清除效果。由图2可知,在实验浓度范围内,色素与BHT对DPPH·的清除率均随浓度的增加而增大,特别是当浓度大于0.3 mg/mL时,色素清除率迅速增大。根据清除率随浓度变化的多项式规律,色素的IC50=0.279 mg/mL,而BHT的IC50=0.334 mg/mL,说明清除半数DPPH·所需的色素浓度低于BHT。由此可知,色素对DPPH·的清除作用强于BHT。

图2　黄姜色素对DPPH·的清除Fig.2　Scavenging rates of pigment extracts from yellow ginger on DPPH·

3.3清除ABTS

ABTS·+是由过硫酸钾氧化ABTS产生的阳离子自由基,其溶液为蓝绿色。抗氧化剂通过与ABTS·+的单电子结合,使自由基减少,颜色变浅程度反映对ABTS·+的清除效果。图3是不同浓度下黄姜色素对ABTS·+的清除率柱状图。

图3　黄姜色素对ABTS·+的清除Fig.3　Scavenging rates of pigment extracts from yellow ginger on ABTS·+

由图3可知,在实验浓度范围内,色素与BHT对ABTS·+清除率随浓度增加而增大,但色素的清除率明显高于BHT。根据清除率随浓度变化的多项式规律,得到色素的IC50=0.123 mg/mL,BHT的IC50=0.449 mg/mL,说明色素对ABTS·+的清除作用明显强于BHT。实验中还发现,改变溶液加入顺序,即将ABTS·+待测液加入到测试溶液中,溶液立即无色,这可能与两者单电子结合时在溶液中的接触空间及反应时间有关。

3.4黄姜色素抑制脂质体过氧化的能力

氧自由基损伤组织的一个重要方式就是体内的脂质过氧化,抑制脂质过氧化物的生成速度或者加速清除生成的过氧化物,均可有效地保护组织细胞,从而延缓机体的衰老过程和对一些疾病的预防与治疗。丙二醛是常用的衡量脂质过氧化损伤程度的一个指标,它是一种脂质过氧化物,能够和机体内的磷脂、蛋白质、核酸等结合生成稳定的不溶性代谢终产物,丙二醛的异常增高会引起细胞损伤,破坏细胞的功能。黄姜色素抑制脂质体过氧化能力的实验结果如图4 所示。

图4　黄姜色素对Fe2+/VC体系诱导大鼠肝微粒体脂质过氧化的抑制作用Fig.4　 Inhibition effects of pigment extracts from yellow ginger on rat liver microsomal lipid peroxidation induced by Fe2+/VC

由图4可知,在实验浓度范围内,黄姜色素表现出了比较好的抑制脂质过氧化的能力,其抑制率为31.52% ～73.61%,且呈较好的量效关系, IC50=0.258 mg/mL。

3.5黄姜色素的还原力

普鲁士蓝法通过抗氧化剂将红色的铁氰化钾还原成黄色的亚铁氰化钾,亚铁氰化钾与游离的Fe3+反应生成普鲁士蓝,根据普鲁士蓝的生成量与吸光值的关系可以判断抗氧化剂的还原能力。

图5　普鲁士蓝法测得黄姜色素的还原能力Fig.5　The antioxidant activity of pigment extracts from yellow ginger by the Prussian blue method

由图5可知,在实验浓度范围内,随浓度的增加,色素与BHT组的吸光值均增大,且色素的吸光值同与之浓度相同的BHT相差不多。由此可知,该法测得色素的还原能力与BHT相当。

4　结　论

1)色素浓度在0.1～0.5 mg/mL范围时,黄姜色素对超氧物阴离子自由基(O2·-)的清除活性略低于BHT;对DPPH·和ABTS的清除活性均高于BHT;且黄姜色素的清除能力随着色素浓度的增加而增大。此外,普鲁士蓝法测得黄姜色素的还原能力与BHT相当。

2)通过研究黄姜色素的抗脂质过氧化能力,结果显示,在实验浓度范围内,黄姜色素对Fe2+/VC体系诱导大鼠肝微粒体脂质过氧化的抑制作用明显,其抑制率为31.52% ～73.61%。

3)本研究通过多种方法全面考察了黄姜色素的抗氧化活性,研究发现,黄姜色素具有较好的抗氧化活性,可作为一种新型的天然抗氧化剂和自由基清除剂,这对进一步开发利用黄姜资源有着重要的意义。

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(编辑陈镱文)

The antioxidant activity of pigment from Dioscorea zingiberensis

GAO Rong1, YANG Xin-lei2, LUO Jun-rong3, LI Wen-hong2

(1.The 451st Hospital of People′s Liberation Army, Xi′an 710054, China; 2.School of Chemical Engineering, Northwest University, Xi′an 710069, China; 3.General Affairs Department，Fourth Military Medical University, Xi′an 710032， China)

The extraction of pigment from Dioscorea zingiberensis.The antioxidant activity of pigment from Dioscorea zingiberensis was investigated by measuring its scavenging ability on superoxide radicals (O2·-)， radicals DPPH·， radicals ABTS and its total Anti-lipid peroxidation and reducing power and reducing power with control for BHT. The results showed that the scavenging ability of pigment on superoxide radicals (O2·-) less than BHT(IC50=0.392mg/mL), the ability to scavenge radicals DPPH and radicals ABTS better than BHT(IC50=0.334mg/mL，IC50=0.123mg/mL), in the range of test concentration, pigment presents a good anti-lipid peroxidation(IC50=0.258mg/mL), moreover, the antioxidant capability of pigment with Prussian blue method is familiar with BHT. Accordingly, the pigment from Dioscorea zingiberensis has a certain antioxidant activity and is a natural antioxidants which can be exploited as a functional food additive and biomedicinals.

pigment extracts from yellow ginger; antioxidant activity; antioxidant activity

2015-03-16

陕西省科技厅自然科学基金资助项目(2014JQ2069)

高蓉，女，陕西西安人，西北大学博士，从事天然药用活性成分分离纯化研究。

李稳宏，男，陕西西安人，西北大学教授，博士生导师，从事制药工程、天然活性成分的分离纯化研究。

R284.2

ADOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-01-011