细胞中药学初探之寒者热之

张　宁，王　征,2，王征帆,3，刘竹兰，刘建利

(1.西北大学 生命科学学院，陕西 西安　710069;2.陕西省中药资源产业化协同创新中心/陕西省中药基础与新药研究重点实验室/陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心,陕西中医学院,陕西 咸阳　712083;3.西北大学 附属中学，陕西 西安　710069)



·生命科学·

细胞中药学初探之寒者热之

张宁1，王征1,2，王征帆1,3，刘竹兰1，刘建利1

(1.西北大学 生命科学学院，陕西 西安710069;2.陕西省中药资源产业化协同创新中心/陕西省中药基础与新药研究重点实验室/陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心,陕西中医学院,陕西 咸阳712083;3.西北大学 附属中学，陕西 西安710069)

用寒凉中药造寒证细胞模型,是否可以用温热中药逆转,验证细胞水平上的“寒者热之”这一中医基本治则。用黄连20 μg/mL、黄柏50 μg/mL、虎杖50 μg/mL造寒证细胞模型,以白胡椒、荜茇、吴茱萸、肉桂4种热药在5 ～ 800 μg/mL浓度范围内分8个浓度梯度进行逆转。所选4味热药对由黄连、黄柏、虎杖的寒性产生的细胞抑制作用有不同程度的逆转。这与动物实验结果一致,从而证明“寒者热之”的中医治则在细胞水平同样适用。“寒者热之”的中医治则在细胞水平上是适用的,弥补了中医药理论在细胞水平认识部分的缺失,为细胞中药学的提出提供了实验依据。

细胞中药学;寒者热之;MTT法;SGC-7901细胞

生命科学对人体的认识经历了从整体、器官、组织、细胞,到分子的过程。细胞是生命的基本单位,在生命科学的认识、发展与研究等过程中起到了重要的作用。中医药理论经千百年的临床实践，通过对人体整体的把握辨证论治，现代科学对中医药的影响,使中医药直接进入了分子水平,从而造成了中医药理论在细胞水平上认识的缺失。随着中医药学与细胞生物学的发展与交叉,一个在细胞水平上认识中医药的学科——细胞中药学就呼之欲出。中药药性理论是中医药理论的重要组成部分。而寒热药性理论又是中药药性理论和中医治法治则的基础。“寒者热之,热者寒之”是中医的基本治则,经几千年临床实践证明,至今仍然指导着中医临床用药[1]。如果要弥补中医药理论在细胞水平认识的缺失,首选应从寒热药性开始,考察“寒者热之,热者寒之”这个中医临床基本治则是否能在细胞水平上实现。实验证明热药作用于细胞促进细胞生长,寒药作用于细胞则抑制细胞生长[2-12]。初步证明寒热药物作用于细胞具有与人体一致的效应。本文探讨用寒凉中药造寒证细胞模型,是否可以用温热中药逆转,进一步验证细胞水平上的“寒者热之”这一中医临床基本治则。

1　材　料

1.1仪器

CO2培养箱(Thermo),超净工作台(苏净安泰),SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices),细胞96孔培养板(耐思生物科技有限公司),DMIL-LED倒置显微镜(leica)。

1.2药品与试剂

黄连(CoptisChinensisFranch.)、黄柏(PhellodendronchinenseSchneid.)、虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.)、白胡椒(PipernigrumL.)、荜茇(PiperlongumL.)、吴茱萸(Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.)、肉桂(CinnamomumcassiaPresl)均购自西安德茂堂大药房,经西北大学生命科学学院房敏峰教授鉴定为正品药材。DMEM培养液(HyClone),胎牛血清(HyClone),MTT(Sigma),0.25%胰蛋白酶(HyClone),二甲基亚砜,磷酸缓冲液。

1.3细胞株

人胃癌细胞株SGC-7901,由第四军医大学提供。

2　方　法

2.1药品溶液的制备

分别称取黄连、黄柏、虎杖、白胡椒、荜茇、吴茱萸、肉桂各25g,加水煎煮3次,每次0.5 h,合并煎液,浓缩,定容至25 mL,使质量浓度为1 g/mL。药液10 000 r/min离心30 min,取上清液,0.22 μm微孔滤膜滤过,无菌水稀释至10 μg/μL,备用。

2.2细胞培养

将SGC-7901细胞消化于含有10%胎牛血清的DMEM培养液(pH 7.0～7.4)中,在37 ℃，5% CO2及饱和湿度条件下的恒温培养箱中传代培养。

2.3MTT试验

分别取对数生长期SGC-7901细胞,照文献方法[2-12]培养。模型组每孔加入等体积不同浓度的寒药,使得造模终质量浓度黄连为20 μg/mL、黄柏为50 μg/mL、虎杖为50 μg/mL。同时设置对照组和调零孔,每个处理组设置3个平行孔。培养24 h后,吸弃含造模药物的培养基,用磷酸缓冲液洗净残留药物,加入新鲜培养基。再分别以白胡椒、荜茇、吴茱萸、肉桂等热药进行逆转。每孔加入等体积不同浓度的热药,使终质量浓度分别为5，10，20，50，100，200，400，800 μg/mL。加药完毕后,培养24 h,更换新鲜培养液(180 μL/孔),每孔加入新鲜配制的MTT溶液(5 g/L)20 μL,照文献方法用酶标仪测定490 nm下吸光度(A)值,计算细胞抑制率[2-12]。

2.4统计学处理

3　结　果

分别用黄连20μg/mL、黄柏50 μg/mL、虎杖50 μg/mL在SGC-7901细胞上造模,以白胡椒、荜茇、吴茱萸、肉桂4味热药在5 ～ 800 μg/mL浓度范围内分8个浓度梯度进行逆转。当黄连质量浓度为20 μg/mL时,对SGC-7901细胞的抑制率为83.25%。分别用白胡椒、荜茇、吴茱萸、肉桂等热药进行逆转,结果见表1。

浓度μg/mL 白胡椒 肉桂 荜茇 吴茱萸 A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%50.234±0.001**82.700.162±0.002**73.090.708±0.001**52.610.246±0.002**49.80100.428±0.104**68.300.194±0.003**67.770.893±0.004**40.220.283±0.004**42.24200.811±0.052*40.000.217±0.003**63.950.811±0.017**45.710.279±0.002**43.06500.707±0.178*47.700.232±0.001**61.461.130±0.034*24.360.289±0.004**41.021000.733±0.065*45.800.349±0.002**42.021.125±0.006**24.700.315±0.004**35.712000.539±0.050**60.100.219±0.008**63.600.892±0.001**40.300.365±0.004*25.514000.485±0.002**64.100.22±0.003**63.450.948±0.002**36.550.416±0.008*15.108000.444±0.036**67.200.173±0.001**71.260.741±0.002**80.400.372±0.005*24.06对照1.352±0.010—0.602±0.001—1.494±0.014—0.490±0.003—

注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。

由表1结果可知,寒药黄连造模后,再加入白胡椒、荜茇、吴茱萸、肉桂等热药,抑制率均为正值,说明细胞生长仍是受抑制的。但是，以上4味热药在5 ～ 800 μg/mL浓度范围内8个浓度的抑制率均小于黄连在20 μg/mL时抑制率83.25%。表明以上4味热药作用于黄连造模细胞后,逆转了黄连对细胞的抑制作用。以上4味热药对黄连(20 μg/mL)的最佳逆转浓度分别是白胡椒20 μg/mL、荜茇400 μg/mL、肉桂100 μg/mL、吴茱萸400 μg/mL。用抑制率对逆转热药浓度作图,以直观反映4味热药对黄连造模细胞的影响,结果见图1。

由图1可知,4味热药曲线均表现为先下降后上升,最低处为每味热药的最佳逆转浓度。而此后抑制率上升是因为热药在高浓度时对细胞产生了抑制作用[2-12]。

当黄柏质量浓度为20μg/mL时,对SGC-7901细胞的抑制率为78.58%。分别用上述4味热药进行逆转,结果见表2。

图1　对黄连造寒证细胞模型的影响Fig.1　Effects of four kinds of hot drugs on cold syndrome cell model which was established with Coptis Chinesis Franch

表2结果表明,4味热药也可以逆转黄柏对细胞生长的抑制作用。最佳逆转浓度分别为白胡椒50 μg/mL、荜茇100 μg/mL、肉桂200 μg/mL、吴茱萸200 μg/mL。用抑制率对药物浓度作图,结果见图2。结果与黄连造模组基本一致。

浓度μg/mL 白胡椒 肉桂 荜茇 吴茱萸 A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%50.455±0.004**80.240.252±0.004**58.140.32±0.001**78.580.248±0.004**49.39100.539±0.006**76.600.301±0.009**50.000.361±0.022**75.840.271±0.006**44.70

续表2

浓度μg/mL 白胡椒 肉桂 荜茇 吴茱萸 A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%200.781±0.001**66.100.279±0.011**53.650.345±0.009**76.910.289±0.001**41.02500.920±0.69360.100.276±0.004**54.150.445±0.014**72.210.320±0.022*34.691000.576±0.002**75.000.357±0.006**40.690.773±0.015**48.260.286±0.001**41.632000.518±0.025**77.500.414±0.001**31.230.646±0.030**56.760.354±0.006**27.764000.690±0.012**70.000.387±0.002**35.710.669±0.014**55.220.328±0.004**33.478000.747±0.017**67.600.324±0.005**46.180.526±0.011**64.790.315±0.007*35.71对照2.303±0.049—0.602±0.001—1.494±0.014—0.490±0.003—

注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。

图2　4味热药对黄柏造寒证细胞模型的影响Fig.2　Effects of four kinds of hot drugs on cold syndrome cell model which was established with Phellodendron Chinense Schneid.

当虎杖质量浓度为50μg/mL时,对SGC-7901细胞的抑制率为65.70%。分别用上述4味热药进行逆转,结果见表3。

4味热药作用于虎杖造模细胞后,在5 ～ 800 μg/mL浓度范围内，8个浓度的抑制率基本上小于虎杖50 μg/mL时的抑制率65.70%,即对虎杖所造寒证细胞模型有逆转作用。4味热药对虎杖的最佳逆转浓度分别为白胡椒200 μg/mL、荜茇200 μg/mL、肉桂5 μg/mL、吴茱萸100 μg/mL。其中肉桂对虎杖的逆转作用特别明显,低浓度即产生明显的抑制作用,但随浓度增大,逆转作用减弱。这个现象很特别,值得进一步研究。而荜茇对虎杖的逆转作用却不明显。为了更加直观地反映这一结果,以抑制率对药物浓度作图,结果见图3。

浓度μg/mL 白胡椒 肉桂 荜茇 吴茱萸 A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%A值抑制率%50.417±0.020**69.16%0.486±0.004*19.270.521±.001**65.130.244±0.001**55.20100.43±0.033**66.200.454±0.015*24.580.518±0.004**65.330.259±0.012*50.30200.428±0.013**66.300.372±0.001**38.200.507±0.002**66.060.275±0.001**47.30500.505±0.001**62.400.347±0.002**42.360.499±0.015**66.600.329±0.002**44.001000.665±0.093*50.800.302±0.006**49.830.561±0.009**62.450.265±0.01**33.002001.074±0.50220.600.283±0.002**52.990.586±0.019**60.780.216±0.003**46.004000.374±0.009**72.300.256±0.001**57.480.514±0.006**65.600.192±0.005**56.008000.499±0.002**63.100.247±0.001**58.970.244±0.002**83.670.491±0.001**60.90对照1.352±0.010—0.602±0.001—1.494±0.014—0.220±0.002—

注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。

图3　4味热药对虎杖造寒证细胞模型的影响Fig.3　Effects of four kinds of hot drugs on cold syndrome cell model which was established with Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.

由图3可知,白胡椒、荜茇、吴茱萸等3条曲线与黄连造模组、黄柏造模组基本一致,均是先下降后上升,最低处即为其最佳逆转浓度。而肉桂曲线只有上升,没有下降,表明起始浓度即为其最佳逆转浓度。

综上,所选白胡椒、荜茇、吴茱萸、肉桂等4味热药对由黄连、黄柏、虎杖3味寒药所造寒证细胞模型均有一定程度的逆转作用。这与动物实验结果一致[1],从而初步证明“寒者热之”的中医治则在细胞水平上是适用的。

4　讨　论

要补上中医药学在细胞水平上的缺失,就有必要研究中药与细胞的相互作用,寻找中药性质与细胞之间的相互关系。中药的首要性质就是寒热药性,我们前期工作显示热药能够促进细胞生长,而寒药则抑制细胞生长,并基于此建立了评价中药寒热药性的细胞学方法[2-12]。

“寒者热之、热者寒之”是中医临床的基本治则。由本文结果可知,在细胞上以寒药造模,再以

热药进行逆转,虽不能完全逆转使细胞达到正常状态,但在一定程度上降低了寒药对细胞的抑制作用。这一结果及趋势与动物实验研究结果一致[1],从而说明在细胞水平上“寒者热之”的治则是适用的。也为细胞中药学提供了新的内容。

[1]梁月华. 寒热本质研究进展 [J]. 中医杂志, 1996, 37(12): 747-750.

[2]程薇薇, 刘建利, 张宁, 等. 评价中药寒热药性的实验方法研究 [J]. 中草药, 2010, 41(7): 1122-1126.

[3]王征, 张宁, 成程, 等. 采用两种细胞模型评价野菊花的寒热属性 [J]. 中草药, 2012, 43(8): 1586-1589.

[4]王征, 张宁, 孙艳妮, 等. 白头翁寒热药性的试验评价 [J]. 药物评价研究, 2013, 36(5): 359-362.

[5]王思文, 张宁, 于涛, 等. 细胞学方法评价9种抗溃疡药的寒热药性 [J]. 西北大学学报(自然科学版), 2014, 44(3): 444-450.

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[9]程薇薇. 中药寒热药性的实验评价方法及物质基础研究 [D].西安：西北大学, 2010.

[10] 王征. 用细胞学方法研究中药寒热药性 [D].西安：西北大学, 2011.

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[12] 杨花. 用细胞学方法研究西药的寒热药性 [D].西安：西北大学, 2013.

(编辑徐象平)

Exploring the cytological effect of Chinese material medica by treating cold syndrome with hot drugs

ZHANG Ning1， WANG Zheng1,2, WANG Zheng-fan1,3, LIU Zhu-lan1, LIU Jian-li1

(1.School of Life Science, Northwest University, Xi′an 710069, China; 2.Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/Shaanxi Province Key Laboratory of New Drugs and Chinese Medicine Foundation Research/Shaanxi Rheumatism and Tumor Center of TCM Engineering Technology Research,Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712083， China; 3.Middle School Attached to Northwest University, Xi′an 710069, China)

To study whether the traditional therapeutic rule “to treat cold syndrome with hot drugs” can apply to the cold syndrome cell model which was established with cold drugs. Three cold herbal drugsCoptisChinensisFranch. (20 μg/mL),PhellodendronchinenseSchneid. (50 μg/mL) andPolygonumcuspidatumSieb. et Zucc. (50 μg/mL) were used to treat the cell to induce cold model. Four kinds of hot drugsPipernigrumL.,PiperlongumL.,Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.,CinnamomumcassiaPresl were used to reverse models. Four hot herbal drugs could cure the cold syndrome and the results were in accordance with that obtained on animal model. The traditional therapeutic rule “to treat cold symptom with hot drug” can apply on cell model.

cytology of Chinese materia medica; “to treat cold syndrome with hot drugs”; MTT assay; SGC-7901

2015-04-07

陕西省自然科学基金资助项目(2014JM4125)；陕西省中医管理局基金资助项目(13-JC012)；陕西省教育厅专项基金资助项目(14JK1737)

张宁，女，陕西宝鸡人，西北大学副教授,博士,从事中药化学成分与药性理论研究。

刘建利,男,陕西西安人，西北大学教授,博士，从事中医药学研究。

R285.1

ADOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-01-014