高三尖杉酯碱与伊马替尼协同诱导慢性粒细胞凋亡

殷世亮，张弘，金戈，王俊平，周凡

（1.沈阳医学院基础医学院药理学教研室，辽宁沈阳110034；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院生理学教研室；3.沈阳军区总医院血液科）

高三尖杉酯碱与伊马替尼协同诱导慢性粒细胞凋亡

殷世亮1，张弘2*，金戈1，王俊平1，周凡3

（1.沈阳医学院基础医学院药理学教研室，辽宁沈阳110034；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院生理学教研室；3.沈阳军区总医院血液科）

目的：考察高三尖杉酯碱（HHT）与伊马替尼（STI571）对人慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）细胞株KU812细胞的凋亡诱导作用。方法：采用AO-EB荧光染色法及PI染色的流式细胞术，考察HHT和STI571分别和联合给药对KU812细胞的凋亡诱导作用；采用Western blot技术考察HHT和STI571对KU812细胞凋亡相关蛋白的影响。结果：HHT能够与STI571协同诱导KU812细胞凋亡，且两者的协同诱导作用呈时间及剂量依赖效应；能显著引起PARP蛋白裂解，并显著下调Bcl-XL蛋白的表达水平。结论：HHT与STI571协同诱导KU812细胞凋亡，具有协同抗CML作用。

高三尖杉酯碱；伊马替尼；细胞凋亡；慢性粒细胞

［Abstract］Objective：To investigate the apoptotic induction effects of homoharringtonine（HHT）combined with imatinib（STI571）on human chronic myeloid leukemia（CML）KU812 cells.Methods：KU812 cells were treated with HHT or/and STI571.Total cell numbers were counted by using hemocytometer.Apoptotic cells were determined by using fluorescence microscope and FACS after staining with AO-EB and PI respectively.The cleavage of poly ADP-ribose polymerase（PARP）and the expression of anti-apoptotic proteins were determined by Western blot.Results：HHT could prompt the apoptotic induction of imatinib in KU812 cells，which was in a time and dose dependent manner.Apoptosis induced by HHT and imatinib was correlated with the down-regulation of Bcl-XL and the cleavage of PARP.Conclusion：HHT prompt apoptotic induction of imatinb in KU812 cells and the combination of HHT with imatinib will provide a more effective strategy for the clinical treatment of CML.

［Key words］homoharringtonine；imatinib；apoptosis；CML

高三尖杉酯碱（homoharringtonine，HHT）是从红豆杉科三尖杉属三尖杉（Cephalotaxus fortumei Hook f.）的枝叶、种子、树皮和根部分离出的具有抗肿瘤活性的生物碱［1-3］。HHT和它的类似物能够抑制蛋白质和DNA的合成。甲磺酸伊马替尼（STI571）是基于人慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）特异表达的融合蛋白BCR/ABL的酪氨酸激酶活性位点设计合成的小分子化合物，2001年经美国FDA批准上市，用于治疗慢性期CML。临床报道表明，STI571耐药的CML细胞对HHT仍然敏感［4-5］。本研究将HHT和BCR/ABL蛋白的小分子抑制剂STI571联合，考察HHT与STI571对CML细胞的凋亡诱导作用，以期为CML的临床治疗提供更为有效的治疗方案。

1　材料与方法

1.1材料人CML细胞株KU812（美国ATCC公司）；RPMI-1640培养液（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；碘化丙啶（PI）、丫啶橙（AO）、溴化乙啶（EB）（美国Sigma公司）；Western blot抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；鼠抗PARP和鼠抗Mcl-1单克隆抗体（美国Cell-Signaling公司）；化学增强发光试剂盒（英国Amersham Biosciences公司）。

1.2细胞培养人CML细胞株KU812细胞均培养于含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、1 mmol/L谷氨酰胺及10%（v/v）经加热灭活的胎牛血清的RPMI-1640培养液中。所有实验用细胞均于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.3AO-EB双染法进行凋亡细胞形态学观察取对数生长期细胞，以每孔1×105/ml的细胞密度接种于24孔板中，每孔加入2 ml培养液。药物作用后，取1 ml细胞悬液，3 000 r/min离心1 min，弃上清液，重悬于50 μl磷酸盐缓冲液（PBS）中，然后加入AO/EB等体积混合液5 μl（100 μg/ml AO，100 μg/ml EB），混匀。取12 μl混合液点于洁净载玻片上，用盖玻片封片，在荧光显微镜490 nm波长下记录并观察细胞的染色情况和形态学改变。细胞呈现AO着色的绿色荧光同时EB拒染，并出现核皱缩、边缘化、发芽、发泡以及凋亡小体等典型凋亡形态的细胞被认为是早期凋亡细胞。细胞若呈现EB着色的红色荧光，说明细胞已经死亡，为坏死细胞或晚期凋亡细胞。

1.4细胞PI染色的流式细胞术检测经药物处理相应时间后离心收集细胞（2×106个），经PBS洗涤后用300 μl PBS重悬细胞，加入20 ml冰预冷的70%乙醇中固定12 h后收集样品。离心收集细胞，于800 μg/ml的RNase溶液中37℃孵育20 min后，加入PI染色液。待测样品DNA含量采用流式细胞术检测，检测激发波长为488 nm，吸收波长为625 nm。纵坐标代表细胞数量，横坐标代表荧光强度即DNA含量。样品经流式细胞术检测采集10 000个细胞。所得数据采用CELLQuest软件（Becton Dickinson）进行处理分析。

1.5Western blot检测研究表明，HHT可以诱导CML细胞的凋亡并下调Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达水平，发挥诱导细胞凋亡作用［3］，因此应用Western blot法检测了HHT和STI571分别及联合处理KU812细胞后Bcl-XL的蛋白水平，以及细胞凋亡指示蛋白PARP（poly-（ADP-ribose）-polymerase）的活化情况。凋亡相关蛋白细胞总蛋白（300 μg）通过RIPA裂解缓冲液［60 mmol/L Tris盐酸，180 mmol/L氯化钠，0.1%十二烷基磺酸钠（SDS），1%NP-40，0.6%脱氧胆酸钠，1 mmol/L PMSF，200 μmol/L leupeptin和3 μg/ml aprotinin，pH 8.0］裂解得到。应用Bradford蛋白定量法定量蛋白，通过SDS-凝胶电泳法分离蛋白，采用Bio-Rad电转仪将蛋白湿转到

PVDF膜上。采用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h后，加入20 ml稀释浓度的待测蛋白特异性单克隆抗体，于4℃结合12 h。TBST洗涤3次后与标记的二抗室温结合1 h后TBST洗涤1次，PVDF膜经化学发光试剂（ECL kit，Amersham Biosciences）处理5 min，PVDF膜与富士胶片于曝光板中压片曝光，经显影液和定影液处理后扫描采集图像。

1.6统计学方法采用SPSS 14.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用One-way ANOVA，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HHT与STI571联合给药诱导KU812细胞凋亡的形态学观察通过AO-EB染色的荧光显微镜观察HHT和STI571分别给药以及联合给药对KU812细胞的凋亡诱导作用。0.2 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571单独处理KU812细胞24 h，均不能诱导细胞凋亡；联合给予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571处理KU812细胞24 h，可观察到显著的细胞凋亡形态图，HHT能够协同STI571诱导KU812细胞凋亡，见图1。

2.2HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的时间依赖性关系分别将0.1 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571单独以及联合处理KU812细胞12、24、48 h，及培养12、24、48 h的KU812细胞作为对照组，采用AO-EB染色的细胞形态学计数法，结果显示，单独给予0.1 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571处理KU812细胞12、24、48 h，诱导KU812细胞凋亡无明显的的时间依赖关系；1 μmol/L STI571联合0.1 μmol/L HHT处理细胞12、24、48 h，分别有20%、47%、86%细胞凋亡，可见HHT与STI571协同诱导KU812细胞凋亡具有显著的时间依赖关系，见图2。

2.3HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的剂量依赖性关系分别将不同浓度HHT和STI571单独以及联合处理KU812细胞24 h，采用AO-EB染色的细胞形态学计数法，结果显示，单独给予0.1、0.2 μmol/L HHT或单独给予1、2 μmol/L STI571处理KU812细胞24 h，诱导KU812细胞凋亡均无明显的剂量依赖关系；1 μmol/L STI571联合0.1、0.2 μmol/L HHT处理细胞24 h，分别有42%和66%细胞凋亡，2 μmol/L STI571联合0.1、0.2 μmol/L HHT处理细胞48 h，分别有72%和87%细胞凋亡，HHT与STI571协同诱导KU812细胞凋亡具有显著的剂量依赖关系，见图3。

图1　HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的细胞形态学观察（×400）

图2　HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的时间依赖性关系

图3　HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的剂量依赖性关系

2.4HHT与STI571联合给药诱导KU812细胞凋亡的流式细胞术检测0.1 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571单独处理KU812细胞24 h，PI染色的流式细胞术结果表明，分别有8.5%和4.9%的细胞发生凋亡，未出现显著的凋亡诱导作用。0.1 μmol/L HHT和1 μmol/LSTI571联合处理KU812细胞24 h，采用PI染色的流式细胞术可以检测到显著的SubG1凋亡峰，约42%的KU812细胞发生凋亡，见图4。

2.5HHT与STI571联合给药对KU812细胞凋亡相关蛋白的影响分别给予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571处理KU812细胞24 h，并不显著改变抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达水平，联合给予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571处理KU812细胞24 h，可以显著下调Bcl-XL蛋白的表达水平，并协同活化PARP凋亡指示蛋白，见图5。

图4　HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的流式细胞术检测

图5　HHT联合STI571对KU812细胞凋亡相关蛋白的影响

3　讨论

近年来的临床研究显示，STI571不能完全根除CML恶性克隆，并已出现了严重的耐药性，据报道，对STI571耐药的CML细胞对HHT仍然敏感，并且HHT对带有T315I BCR/ABL酪氨酸激酶点突变的STI571耐药细胞仍然有治疗效果［6-7］。因此将HHT与STI571联合给予CML患者将会取得良好的治疗效果，并克服肿瘤的耐药。

本实验中HHT联合STI571协同诱导CML细胞系KU812细胞凋亡，并呈良好的时间依赖和剂量依赖关系。0.1和0.2 μmol/L HHT处理KU812细胞24、48 h不能够诱导细胞凋亡的发生，同样单独给予1和2 μmol/L STI571处理KU812细胞24、48 h也不能够诱导细胞凋亡的发生，但将两者联合给药可显著地诱导KU812细胞凋亡。本研究结果表明，HHT与STI571联合能够显著诱导CML细胞系KU812凋亡，二者具有协同抗CML作用。

HHT联合STI571可以显著地引起KU812细胞Bcl-XL的表达下调，并伴随着凋亡标准性蛋白PARP的裂解活化。Bcl-XL为Bcl-2家族中重要凋亡抑制蛋白，Bcl-XL的下调表达可以引起肿瘤细胞的凋亡［8］。本研究提示HHT可能通过下调Bcl-XL抗凋亡蛋白发挥协同STI571诱导细胞凋亡的抗CML作用。

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Homoharringtonine Prompt Apoptotic Induction of Imatinib in CML Cells

YIN Shiliang1，ZHANG Hong2*，JIN Ge1，WANG Junping1，ZHOU Fan3
（1.Department of Pharmacology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Physiology，School of Life Science and Biopharmaceutics，Shenyang Pharmaceutical University；3.Shenyang Military General Hospital）

R965

A

1008-2344（2016）05-0332-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.004

2016-03-16

（文敏 编辑）

沈阳医学院优秀人才项目（No.20123045）；辽宁省教育厅一般项目（No.L2013402）

殷世亮（1980—），男（汉），博士，讲师，研究方向：抗肿瘤药物作用机制研究.E-mail：yslal@163.com

张弘（1981—），女（汉），博士，讲师，研究方向：抗肿瘤药物作用机制研究.E-mail：song0688@sina.com