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高三尖杉酯碱与伊马替尼协同诱导慢性粒细胞凋亡

2016-10-22殷世亮张弘金戈王俊平周凡

沈阳医学院学报 2016年5期
关键词:形态学染色协同

殷世亮,张弘,金戈,王俊平,周凡

(1.沈阳医学院基础医学院药理学教研室,辽宁沈阳110034;2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院生理学教研室;3.沈阳军区总医院血液科)

高三尖杉酯碱与伊马替尼协同诱导慢性粒细胞凋亡

殷世亮1,张弘2*,金戈1,王俊平1,周凡3

(1.沈阳医学院基础医学院药理学教研室,辽宁沈阳110034;2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院生理学教研室;3.沈阳军区总医院血液科)

目的:考察高三尖杉酯碱(HHT)与伊马替尼(STI571)对人慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞株KU812细胞的凋亡诱导作用。方法:采用AO-EB荧光染色法及PI染色的流式细胞术,考察HHT和STI571分别和联合给药对KU812细胞的凋亡诱导作用;采用Western blot技术考察HHT和STI571对KU812细胞凋亡相关蛋白的影响。结果:HHT能够与STI571协同诱导KU812细胞凋亡,且两者的协同诱导作用呈时间及剂量依赖效应;能显著引起PARP蛋白裂解,并显著下调Bcl-XL蛋白的表达水平。结论:HHT与STI571协同诱导KU812细胞凋亡,具有协同抗CML作用。

高三尖杉酯碱;伊马替尼;细胞凋亡;慢性粒细胞

[Abstract]Objective:To investigate the apoptotic induction effects of homoharringtonine(HHT)combined with imatinib(STI571)on human chronic myeloid leukemia(CML)KU812 cells.Methods:KU812 cells were treated with HHT or/and STI571.Total cell numbers were counted by using hemocytometer.Apoptotic cells were determined by using fluorescence microscope and FACS after staining with AO-EB and PI respectively.The cleavage of poly ADP-ribose polymerase(PARP)and the expression of anti-apoptotic proteins were determined by Western blot.Results:HHT could prompt the apoptotic induction of imatinib in KU812 cells,which was in a time and dose dependent manner.Apoptosis induced by HHT and imatinib was correlated with the down-regulation of Bcl-XL and the cleavage of PARP.Conclusion:HHT prompt apoptotic induction of imatinb in KU812 cells and the combination of HHT with imatinib will provide a more effective strategy for the clinical treatment of CML.

[Key words]homoharringtonine;imatinib;apoptosis;CML

高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)是从红豆杉科三尖杉属三尖杉(Cephalotaxus fortumei Hook f.)的枝叶、种子、树皮和根部分离出的具有抗肿瘤活性的生物碱[1-3]。HHT和它的类似物能够抑制蛋白质和DNA的合成。甲磺酸伊马替尼(STI571)是基于人慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)特异表达的融合蛋白BCR/ABL的酪氨酸激酶活性位点设计合成的小分子化合物,2001年经美国FDA批准上市,用于治疗慢性期CML。临床报道表明,STI571耐药的CML细胞对HHT仍然敏感[4-5]。本研究将HHT和BCR/ABL蛋白的小分子抑制剂STI571联合,考察HHT与STI571对CML细胞的凋亡诱导作用,以期为CML的临床治疗提供更为有效的治疗方案。

1 材料与方法

1.1材料人CML细胞株KU812(美国ATCC公司);RPMI-1640培养液(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Hyclone公司);碘化丙啶(PI)、丫啶橙(AO)、溴化乙啶(EB)(美国Sigma公司);Western blot抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司);鼠抗PARP和鼠抗Mcl-1单克隆抗体(美国Cell-Signaling公司);化学增强发光试剂盒(英国Amersham Biosciences公司)。

1.2细胞培养人CML细胞株KU812细胞均培养于含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、1 mmol/L谷氨酰胺及10%(v/v)经加热灭活的胎牛血清的RPMI-1640培养液中。所有实验用细胞均于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.3AO-EB双染法进行凋亡细胞形态学观察取对数生长期细胞,以每孔1×105/ml的细胞密度接种于24孔板中,每孔加入2 ml培养液。药物作用后,取1 ml细胞悬液,3 000 r/min离心1 min,弃上清液,重悬于50 μl磷酸盐缓冲液(PBS)中,然后加入AO/EB等体积混合液5 μl(100 μg/ml AO,100 μg/ml EB),混匀。取12 μl混合液点于洁净载玻片上,用盖玻片封片,在荧光显微镜490 nm波长下记录并观察细胞的染色情况和形态学改变。细胞呈现AO着色的绿色荧光同时EB拒染,并出现核皱缩、边缘化、发芽、发泡以及凋亡小体等典型凋亡形态的细胞被认为是早期凋亡细胞。细胞若呈现EB着色的红色荧光,说明细胞已经死亡,为坏死细胞或晚期凋亡细胞。

1.4细胞PI染色的流式细胞术检测经药物处理相应时间后离心收集细胞(2×106个),经PBS洗涤后用300 μl PBS重悬细胞,加入20 ml冰预冷的70%乙醇中固定12 h后收集样品。离心收集细胞,于800 μg/ml的RNase溶液中37℃孵育20 min后,加入PI染色液。待测样品DNA含量采用流式细胞术检测,检测激发波长为488 nm,吸收波长为625 nm。纵坐标代表细胞数量,横坐标代表荧光强度即DNA含量。样品经流式细胞术检测采集10 000个细胞。所得数据采用CELLQuest软件(Becton Dickinson)进行处理分析。

1.5Western blot检测研究表明,HHT可以诱导CML细胞的凋亡并下调Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达水平,发挥诱导细胞凋亡作用[3],因此应用Western blot法检测了HHT和STI571分别及联合处理KU812细胞后Bcl-XL的蛋白水平,以及细胞凋亡指示蛋白PARP(poly-(ADP-ribose)-polymerase)的活化情况。凋亡相关蛋白细胞总蛋白(300 μg)通过RIPA裂解缓冲液[60 mmol/L Tris盐酸,180 mmol/L氯化钠,0.1%十二烷基磺酸钠(SDS),1%NP-40,0.6%脱氧胆酸钠,1 mmol/L PMSF,200 μmol/L leupeptin和3 μg/ml aprotinin,pH 8.0]裂解得到。应用Bradford蛋白定量法定量蛋白,通过SDS-凝胶电泳法分离蛋白,采用Bio-Rad电转仪将蛋白湿转到

PVDF膜上。采用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h后,加入20 ml稀释浓度的待测蛋白特异性单克隆抗体,于4℃结合12 h。TBST洗涤3次后与标记的二抗室温结合1 h后TBST洗涤1次,PVDF膜经化学发光试剂(ECL kit,Amersham Biosciences)处理5 min,PVDF膜与富士胶片于曝光板中压片曝光,经显影液和定影液处理后扫描采集图像。

1.6统计学方法采用SPSS 14.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用One-way ANOVA,两两比较采用q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HHT与STI571联合给药诱导KU812细胞凋亡的形态学观察通过AO-EB染色的荧光显微镜观察HHT和STI571分别给药以及联合给药对KU812细胞的凋亡诱导作用。0.2 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571单独处理KU812细胞24 h,均不能诱导细胞凋亡;联合给予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571处理KU812细胞24 h,可观察到显著的细胞凋亡形态图,HHT能够协同STI571诱导KU812细胞凋亡,见图1。

2.2HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的时间依赖性关系分别将0.1 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571单独以及联合处理KU812细胞12、24、48 h,及培养12、24、48 h的KU812细胞作为对照组,采用AO-EB染色的细胞形态学计数法,结果显示,单独给予0.1 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571处理KU812细胞12、24、48 h,诱导KU812细胞凋亡无明显的的时间依赖关系;1 μmol/L STI571联合0.1 μmol/L HHT处理细胞12、24、48 h,分别有20%、47%、86%细胞凋亡,可见HHT与STI571协同诱导KU812细胞凋亡具有显著的时间依赖关系,见图2。

2.3HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的剂量依赖性关系分别将不同浓度HHT和STI571单独以及联合处理KU812细胞24 h,采用AO-EB染色的细胞形态学计数法,结果显示,单独给予0.1、0.2 μmol/L HHT或单独给予1、2 μmol/L STI571处理KU812细胞24 h,诱导KU812细胞凋亡均无明显的剂量依赖关系;1 μmol/L STI571联合0.1、0.2 μmol/L HHT处理细胞24 h,分别有42%和66%细胞凋亡,2 μmol/L STI571联合0.1、0.2 μmol/L HHT处理细胞48 h,分别有72%和87%细胞凋亡,HHT与STI571协同诱导KU812细胞凋亡具有显著的剂量依赖关系,见图3。

图1 HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的细胞形态学观察(×400)

图2 HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的时间依赖性关系

图3 HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的剂量依赖性关系

2.4HHT与STI571联合给药诱导KU812细胞凋亡的流式细胞术检测0.1 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571单独处理KU812细胞24 h,PI染色的流式细胞术结果表明,分别有8.5%和4.9%的细胞发生凋亡,未出现显著的凋亡诱导作用。0.1 μmol/L HHT和1 μmol/LSTI571联合处理KU812细胞24 h,采用PI染色的流式细胞术可以检测到显著的SubG1凋亡峰,约42%的KU812细胞发生凋亡,见图4。

2.5HHT与STI571联合给药对KU812细胞凋亡相关蛋白的影响分别给予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571处理KU812细胞24 h,并不显著改变抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达水平,联合给予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571处理KU812细胞24 h,可以显著下调Bcl-XL蛋白的表达水平,并协同活化PARP凋亡指示蛋白,见图5。

图4 HHT联合STI571协同诱导KU812细胞凋亡的流式细胞术检测

图5 HHT联合STI571对KU812细胞凋亡相关蛋白的影响

3 讨论

近年来的临床研究显示,STI571不能完全根除CML恶性克隆,并已出现了严重的耐药性,据报道,对STI571耐药的CML细胞对HHT仍然敏感,并且HHT对带有T315I BCR/ABL酪氨酸激酶点突变的STI571耐药细胞仍然有治疗效果[6-7]。因此将HHT与STI571联合给予CML患者将会取得良好的治疗效果,并克服肿瘤的耐药。

本实验中HHT联合STI571协同诱导CML细胞系KU812细胞凋亡,并呈良好的时间依赖和剂量依赖关系。0.1和0.2 μmol/L HHT处理KU812细胞24、48 h不能够诱导细胞凋亡的发生,同样单独给予1和2 μmol/L STI571处理KU812细胞24、48 h也不能够诱导细胞凋亡的发生,但将两者联合给药可显著地诱导KU812细胞凋亡。本研究结果表明,HHT与STI571联合能够显著诱导CML细胞系KU812凋亡,二者具有协同抗CML作用。

HHT联合STI571可以显著地引起KU812细胞Bcl-XL的表达下调,并伴随着凋亡标准性蛋白PARP的裂解活化。Bcl-XL为Bcl-2家族中重要凋亡抑制蛋白,Bcl-XL的下调表达可以引起肿瘤细胞的凋亡[8]。本研究提示HHT可能通过下调Bcl-XL抗凋亡蛋白发挥协同STI571诱导细胞凋亡的抗CML作用。

[1]Kantarjian HM,Talpaz M,Santini V,et al.Homoharringtonine:history,current research,and future directions[J].Cancer,2001,92(6):1591-1605.

[2]Powell RG,Weisleder D,Smith CR Jr.Anritumor alkaloids for Cephalataxus harringtoninia:structure and activity[J].J Pharm Sci,1972,61(8):1227-1230.

[3]Yin S,Wang R,Zhou F,et al.Bcl-XL is a dominant antiapoptotic protein that inhibits homoharringtonine-induced apoptosis in leukemia cells[J].Mol Pharmacol,2011,79(6):1072-1083.

[4]Chen R,Varsha G,Plunkett W.A sequential blockade strategy for the design of combination therapies to overcome oncegene addiction in chronic myelogenous leukemia[J].Cancer Res,2006,66(22):10959-10966.

[5]O'Brien S,Giles F,Talpaz M,et al.Results of triple therapy with interferon-alpha,cytarabine,and homoharringtonine,and the impact of adding imatinib to the treatment sequence in patients withPhiladelphiachromosome-positivechronicmyelogenous leukemia in early chronic phase[J].Cancer,2003,98(5):883-893.

[6]Quintás-Cardama A,Kantarjian H,Cortes J.Phase 1/2 study of subcutaneous homoharringtonine in patients with chronic myeloid leukemia who have failed prior therapy[J].Cancer,2007,109(5):248-255.

[7]de Lavallade H,Khorashad JS,Davis HP,et al.Interferonalpha or homoharringtonine as salvage treatment for chronic myeloid leukemia patients who acquire the T315I BCR-ABL mutation[J]. Blood,2007,110(7):2779-2780.

[8]Amaracte-Mendes GP,McGahon AJ,Nishioka WK,et al.Bcl-2independentBcr-Abl-mediatedresistancetoapoptosis:protection is correlated with up regulation of Bcl-XL[J]. Oncogene,1998,16(11):1383-1390.

Homoharringtonine Prompt Apoptotic Induction of Imatinib in CML Cells

YIN Shiliang1,ZHANG Hong2*,JIN Ge1,WANG Junping1,ZHOU Fan3
(1.Department of Pharmacology,Shenyang Medical College,Shenyang 110034,China;2.Department of Physiology,School of Life Science and Biopharmaceutics,Shenyang Pharmaceutical University;3.Shenyang Military General Hospital)

R965

A

1008-2344(2016)05-0332-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.004

2016-03-16

(文敏 编辑)

沈阳医学院优秀人才项目(No.20123045);辽宁省教育厅一般项目(No.L2013402)

殷世亮(1980—),男(汉),博士,讲师,研究方向:抗肿瘤药物作用机制研究.E-mail:yslal@163.com

张弘(1981—),女(汉),博士,讲师,研究方向:抗肿瘤药物作用机制研究.E-mail:song0688@sina.com

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