多种分离方法分离脐血造血细胞效率的比较

王丹丹 林莹 武文杰 李茜

摘 要：目的：比较多种分离方法分离脐血造血细胞的效率。方法：依据随机方法将133例脐血标本分为3组，A组选择HES法，B组选择Ficoll法，C组选择明胶法。所有标本均进行CD34+细胞检测，同时进行造血祖细胞体外培养。结果：A组CD34+细胞产率明显高于B组，C组CD34+细胞产率明显高于B组，A组CD34+细胞产率明显C组，组间两两比较差异有统計学意义（P<0.05）；A组CFCs产率明显高于B组，C组CFCs产率明显高于B组，A组CFCs产率明显C组，组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：在分离脐血造血细胞过程中，HES法的分离效率高于HES法、明胶法。

关键词：脐血造血细胞；HES法；Ficoll法；明胶法；效率

脐血造血细胞分离是脐血移植过程中的重要环节，也是脐血库建立的关键性步骤，对血液病患者的疾病治疗有着重要的作用。目前，最常见的脐血造血细胞分离方法为HES法、Ficoll法、明胶法，其中HES法的分离效率较高，其体积浓缩效果较好。本研究将133例脐血标本分为3组，3组分别应用HES法、Ficoll法及明胶法，比较3组的分离效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究共133例脐血标本，均由我市某医院妇产科提供，脐血标本采集量50.2-140.5ml，平均81.7ml。标本采集后保存于4℃的温度条件下，保存时间控制在24h之内。依据随机方法，将133例脐血标本分为3组，A组45例，B组44例，C组44例。

1.2 方法

1.2.1 HES法

A组45例标本选择HES法，即在整份脐血中加入25%的羟乙基淀粉60g/L，混合均匀后进行500r/min离心处理，时间控制在5min，之后去掉红细胞，再进行1200r/min离心处理，时间控制在13min，将部分血浆去掉，确保体积浓缩至25ml左右，最后将白细胞重悬在剩余的血浆中。

1.2.2 Ficoll法

B组44例标本选择Ficoll法，即选择Ficoll 10ml，相对密度为1.077，将其置于离心管（50ml）中。每例标本取10ml脐血，并置于液面上，之后进行1800r/min离心处理，时间控制在10min，选择白细胞层重悬在RPMI 1640培养液10ml中。

1.2.3 明胶法

C组44例标本选择明胶法，即从44例标本中顺利取出20ml，并放置于离心管（50ml）与30g/L明胶（20ml）中，混合均匀后，进行30min沉降处理，之后将上清液置于另一个离心管（50ml）中，添加50% 30g/L明胶，进行30min沉淀处理，保留上清液。

1.2.4 CD34+细胞检测

抗体主要选择美国Pharmigen公司生产的抗人CD34抗体，同时选择美国BectonDick-inshon公司生产的流式细胞仪进行检测。将抗体20μl置入脐血100μl中，混合均匀后在4℃温度条件下进行30min孵育，选择氯化铵裂解红细胞，时间控制在30min，之后进行两次PBS洗涤，选择多聚甲醛进行固定后再实施检测，同时开淋巴细胞窗。

1.2.5 造血祖细胞体外培养

选择体外培养方法，培养体系主要选择甲基纤维素半固体培养基，其包括四个成分，即白细胞介素-3（10ng/ml）、粒细胞集落刺激因子（200ng/ml）、干细胞因子（50ng/ml）、红细胞生成素（1U/ml）。选择2×105个有核细胞，将其置于2ml培养体系中，并在体积分数保持在5% CO2、温度保持在37℃基础上进行14d的培养，之后分别计数BFU-E、CFU-GM以及CFU-Mix，同时准确计算出三者之和，即CFCs[1]。

1.3 统计学方法

选择SPSS10.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，选择ANOVA与 Bonferroni 两两比较方法进行分析，当P<0.05时表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD34+细胞产率

A组分离前CD34+细胞为（8.81±1.90）×107，分离后CD34+细胞为（8.67±1.67）×107，产率为（98.15±5.68）%；B组分离前CD34+细胞为（1.08±0.40）×107，分离后CD34+细胞为（0.36±0.01）×107，产率为（32.85±4.77）%；C组分离前CD34+细胞为（2.17±0.69）×107，分离后CD34+细胞为（2.08±10.36）×107，产率为（81.46±5.93）%。A组CD34+细胞产率高于B组，C组CD34+细胞产率高于B组，A组CD34+细胞产率高于C组，组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 CFCs产率

A组分离前 CFCs为（2.41±0.31）×106，分离后CFCs为（2.20±0.33）×106，产率为94.56%；B组分离前 CFCs为（3.07±0.40）×105，分离后CFCs为（9.57±0.86）×104，产率为30.87%；C组分离前 CFCs为（5.88±0.81）×105，分离后CFCs为（5.22±0.58）×105，产率为78.49%。A组CFCs产率高于B组，C组CFCs产率高于B组，A组CFCs产率高于C组，组间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

脐血是临床医学中重要的造血干细胞来源，其可以替代骨髓实施造血干细胞移植，在血液疾病治疗中发挥重要的作用。在脐血移植及脐血库建立中，脐血干细胞分离技术起着积极性的作用，科学、有效的分离技术可以快速分离脐血中的有核细胞，为脐血库的建立奠定基础[2]。

Ficoll法、明胶法、HES法是目前科研中广泛应用的脐血干细胞分离方法，不同的分离方法，其对造血细胞回收所产生的影响也有所不同，分离效率也不尽相同。运用Ficoll法进行分离，CD34+细胞损失超过60%以上，干细胞丢失严重，且每次仅可分离出较少的脐血量，在脐血库建立中存在一定的局限性。应用明胶法分离时，CD34+细胞损失率低于Ficoll法，CFCs损失率也比较低，对脐血库建立非常有利，但经明胶分离后，终体积所占的比率比较大，约为原体积的75%。HES法具有操作简单、用时少、分离效率高、体积浓缩效果好等多种优点，其CD34+细胞损失率通常不超过5%，CFCs损失率通常不超过10%，且其分离后终体积所占的比率比较小，通常不超过原体积的25%。本研究将133例脐血标本分为3组，A组应用HES法，B组应用Ficoll法，C组应用明胶法，结果显示，A组CD34+细胞产率及CFCs产率均高于B组、C组，证实HES法分离脐血造血细胞的效率高于Ficoll法、明胶法。

综上所述，在分离脐血造血细胞中，HES法分离效率较高，其分离效果优于Ficoll法与明胶法，有助于脐血库建立，是分离脐血造血细胞首选的方法，值得推广。

参考文献

[1]王颖超，殷楚云，冯磊，等.三种不同方法分离脐血造血干细胞的效果比较[J].实用儿科临床杂志，2012，27（10）：766-768+794.

[2]陈林，张坤，邵文陶，等.脐带血造血干细胞分离冻存方法优化[J].重庆理工大学学报（自然科学），2014，28（12）：82-86.