枸芪复肾丸质量标准研究※

崔成姬 邹 迪 张洪宝 张守琳

枸芪复肾丸质量标准研究※

崔成姬 邹 迪 张洪宝 张守琳

目的 建立枸芪复肾丸质量标准。方法 将枸芪复肾丸中枸杞子、黄芪、当归采用薄层色谱法进行定性检测，对处方中君药黄芪中有效成份黄芪甲苷以及臣药当归中有效成份阿魏酸采用高效液相色谱法进行定量检测。结果 在薄层色谱中能检出枸杞子、黄芪和当归；含量测定中黄芪甲苷在1.978～9.890 μg范围内线性关系良好（r=0.9995）；阿魏酸含量在0.05～0.5 μg范围内呈良好的线性关系（r=0.9993）。结论 建立的分析方法简便可行，专属性强，可用于枸芪复肾丸的质量控制。

枸芪复肾丸；薄层色谱法；高效液相色谱法

枸芪复肾丸是由枸杞子、当归、黄芪等17味中药组成，是根据长春中医药大学附属医院名老中医多年临床经验研制而成，具有滋阴补肾、健脾利湿，活血化瘀的作用，自1996年枸芪复肾丸作为院内制剂主要用于治疗慢性肾炎伴血尿、少量蛋白尿，在临床已应用19年，其可明显改善患者症状、体征［1］。科学的质量标准有利于制剂的质量稳定、确保使用安全［2］。本研究就枸芪复肾丸的质量标准制订了简便可行、准确可靠的定性、定量检测方法，为建立枸芪复肾丸的质量评价体系提供初步依据。

1 仪器与试剂

1.1仪器 岛津LC-10AT高效液相色谱仪；N2000色谱工作站；BSA124S 型电子天平。

1.2试剂与药品 黄芪甲苷，批号：110781-200613；阿魏酸对照品，中国药品生物制品检定所，批号：110773-201208；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯；枸芪复肾丸，长春中医药大学附属医院，长卫药制字（96）1413号。

1.3枸芪复肾丸组成 槐花372 g、当归148.8 g、白茅根372 g、赤芍111.6 g、茯苓372 g、枸杞子148.8 g、女贞子223.2 g、红花111.6 g、墨旱莲223.2 g、益母草223.2 g、牡丹皮148.8 g、地黄223.2 g、大蓟223.2 g、小蓟223.2 g、栀子111.6 g、大黄74.4 g、黄芪148.8 g。

2 方法与结果

2.1黄芪的薄层色谱鉴别 取枸芪复肾丸8 g放入三角瓶内，加甲醇处理，滤过，蒸干，残渣加水使其溶解，以水饱和正丁醇反复提取3次，将3次正丁醇液混合，放入浓氨试液反复洗涤5次，将氨试液丢弃，把正丁醇液水浴蒸干，最后用甲醇使残渣溶解，当作供试品溶液。另取对照品黄芪甲苷，将对照品加入甲醇中制成每升含1 mg的对照品溶液；按照薄层色谱法试验，吸取各10 μl上述两种溶液，先后点于相同硅胶G薄层板上，展开剂为氯仿-甲醇-水（比例为13：7：2）的10 ℃放置的下层溶液，先后给予展开、取出、晾干，喷上10%硫酸乙醇溶液，用热风吹至斑点清晰显色，最后至365 nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与相应的对照品色谱的位置上，显示相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰，结果见图1。

图1　黄芪薄层层析图（1为黄芪甲苷对照品，2、3、4为三批供试品）

2.2枸杞子的薄层色谱鉴别 取枸芪复肾丸6 g放入三角瓶内，添加常温水，加温煮沸15 min，再放冷、滤过，乙酸乙酯振摇提取滤液，同时用乙酸乙酯液浓缩至1 ml，此为供试品溶液。同法制成枸杞子对照药材；按照薄层色谱法（附录VIB）试验，上述两种溶液各吸取5 μl，分别点于相同硅胶G薄层板上，展开剂为乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3：2：1），依次展开、取出、晾干，至365 nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰，结果见图2。

图2　枸杞子薄层层析图（1为枸杞子对照药材，2、3、4为三批供试品）

2.3当归的薄层色谱鉴别 取药丸3 g，放入提取器中，加甲醇提取至近无色，回收甲醇，残渣加水20 ml溶解，冷却，转移至分液漏斗中，用乙醚提取3次，每次10 ml，合并乙醚液，乙醚液用2%碳酸钠溶液提取3次，每次10 ml，弃去乙醚液，碱液用醋酸乙酯15 ml洗脱一次，弃去醋酸乙酯，碱液加盐酸酸化至pH 2～3，再用苯15 ml洗脱1次，弃去苯液，继用乙醚提取3次，每次10 ml，挥去乙醚，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。取出阿魏酸钠对照品，加入甲醇制成溶液浓度为1 mg/ml，此为对照品溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取容量为10 μl的供试品溶液和5 μl的对照品溶液，依次点于相同硅胶G薄层板上，以苯-冰醋酸-甲醇（30：1：3）为展开剂，20 ℃以下展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检测。供试品色谱中，在与对照药材色谱定量检测，阴性无干扰，结果见图3。

图3　当归薄层层析图（1为阿魏酸对照药品，2、3、4为三批供试品）

3 含量测定

采用高效液相色谱法（HPLC），通过制作标准曲线，用外标一点法计算本品中各有效成分的含量。

3.1黄芪甲苷

3.1.1色谱条件 色谱柱：Nova-PaK（R）C18（3.9 mm ×150 mm Columm）；流动相：乙腈-水（37：63）；流速：0.8 ml/min；进样量：20 μl。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算不低于2000。在此条件下，样品分离良好。

3.1.2对照品溶液配制 2 ml量瓶中放入黄芪甲苷对照品1.977 mg，用甲醇溶解后定容，配成浓度为0.989 mg/ml的溶液。

3.1.3供试品溶液制备 抽取本品5 ml，使用水饱和的正丁醇5 ml分别萃取6次，再采用40%氨水25 ml洗涤，合并正丁醇液。丢弃碱水层，一直回收正丁醇层直至干燥，放入甲醇溶解并定容至10 ml，过微孔滤膜，取20 μl进样。

3.1.4阴性对照品制备 制作不含黄芪的阴性样品（参照枸芪复肾丸制备工艺），阴性对照溶液按供试品溶液制备方法制作。

3.1.5线性关系考察 分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml的对照品溶液，放入容积为1 ml的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样量20 μl，用外标一点法计算本品黄芪甲苷含量。峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。得回归方程为y=7.1421x－1.4661，相关系数r=0.9995。表明在1.978～9.890 μg范围内黄芪甲苷线性关系良好。

3.1.6精密度试验 取标准曲线中的对照品溶液20 μl（质量浓度为0.297 mg/ml），重复进样6次，测得黄芪甲苷相对标准偏差（RSD）为0.98%。

3.1.7稳定性试验 取精密度试验样品，在0、12、48 h后进行测定，黄芪甲苷RSD=1.23%，表明该方法稳定性良好。

3.1.8重复性试验 取同一批枸芪复肾丸（批号：20140812），按样品的制备方法制备供试品溶液，并进行测定，测得黄芪甲苷RSD=0.16%，表明该方法重复性较好。

3.1.9回收率实验 精密称取样品共6份，各约1.0 g，分别加入对照品黄芪甲苷溶液5.0 ml，按样品色谱条件测定计算平均回收率为99.15%，RSD为1.22%，表明本法加样回收率良好。

表1　黄芪甲苷回收率试验

3.2阿魏酸［3］

3.2.1色谱条件 Nova-PaK（R）C18（3.9 mm×150 mm Columm）；流动相：甲醇色谱纯溶液：1%冰醋酸溶液（37：63）；检测波长：323 nm；流速：0.5 ml/min；灵敏度：0.05AUFS。

3.2.2阿魏酸标准溶液的配制 精密称取阿魏酸标准制备1 mg，用流动相溶液配制为1 mg/ml的溶液。再进一步稀释为5、8、10、20、30、40 μg/ml的标准品溶液。

3.2.3阿魏酸样品溶液配制 取之前薄层色谱方法中提取的1 ml阿魏酸供试品溶液，将甲醇溶液挥干后，样品溶液用流动相溶液1 ml溶解制成。

3.2.4阴性对照品配制 制作不含当归的阴性样品（按枸芪复肾丸制备工艺），阴性对照溶液按供试品溶液的制备方法制成。

3.2.5线性关系考察 分别吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml的对照品溶液，放入容积为1 ml的量瓶中，稀释液用甲醇，摇匀，进样量为20 μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。用外标一点法计算本品阿魏酸含量。通过以峰面积为纵坐标，以阿魏酸标准品的含量为横坐标制作标准曲线。得到回归方程：y=2.4107x－1.6091，R2=0.9993。在0.05～0.5 μg范围内阿魏酸含量呈良好的线性关系。

3.2.6精密度试验 取标准曲线中的质量浓度为0.286 mg/ml的对照品溶液20 μl，反复进样6次，测得阿魏酸RSD=0.96%。

3.2.7稳定性试验 取精密度试验的样品，在0、12、48 h后进行测定，阿魏酸RSD=1.34%，表明该方法稳定性良好。

3.2.8重复性试验 取同一批枸芪复肾丸（批号：20140812），按样品的制备方法制备供试品溶液，并进行测定，测得阿魏酸RSD=0.16%，表明该方法重复性较好。

3.2.9回收率实验 精密称取样品共6份，各约1.0 g，分别加入对照品阿魏酸溶液5.0 ml，按样品色谱条件测定计算平均回收率为99.24%，RSD为1.30%，表明本法加样回收率良好。

表2　阿魏酸回收率试验

4 讨论

本实验利用薄层层析方法分别对该制剂中枸杞子、黄芪、当归进行定性鉴别，并建立了制剂中黄芪的主要有效成分黄芪甲苷的高效液相色谱定量分析方法，同时建立了制剂中当归主要成分阿魏酸的高效液相色谱定量分析方法。黄芪甲苷可以减轻过氧化氢诱导的肾小球系膜细胞的氧化应激损伤［4］，阿魏酸（4-羟-3-甲氧基肉桂酸）具有抗血小板聚集、缓解血管痉挛等作用，故本药具有治疗血尿和蛋白尿的作用。本实验建立的方法操作简单，专属性强，重复性好，结果准确，可用于枸芪复肾丸的质量控制与分析。

［1］张守琳，王银萍，王宏安.枸芪复肾丸治疗慢性肾炎的临床研究［J］.中国中西医结合肾病杂志，2015，16（12）：1082-1083.

［2］伍振峰，郑琴，杨明.中药制剂质量控制的方法模式分析与研究［J］.中国中药志，2012，37（9）：1332-1336.

［3］游蓉丽，李明花，乔玉峰，等.HPLC测定注射用阿魏酸钠含量［J］.中国中药杂志，2014，11（10）：19-21.

［4］曹玲玲，李维祖，司秀莲，等.黄芪甲苷对肾小球系膜细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制［J］.中国中药杂志，2013，38（5）：725-730.

R927.11

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.09.005

长春中医药大学附属医院，吉林长春 130021

吉林省中医中药管理局基金资助项目（2014-ZC47）；吉林省科技厅基金资助项目（20130206071YY）；吉林省教育厅基金资助项目（2014第65号）