IL-10基因多态性及血清水平与颅内动脉瘤发病的关系

邵得明，邱虹，于向东，马向辉，李云超，王玉珏

IL-10基因多态性及血清水平与颅内动脉瘤发病的关系

邵得明1，邱虹2，于向东2，马向辉1，李云超2，王玉珏2

目的分析白细胞介素（IL）-10基因启动子区-1082G/A、-819C/T单核苷酸多态性（SNP）及血清IL-10水平与颅内动脉瘤（IAs）发病的关系。方法运用PCR及DNA直接测序的方法，检测206例IAs患者（IAs组）和187例非IAs患者（对照组）的IL-10基因启动子区SNP位点，-1082G/A、-819C/T的基因型频率和等位基因频率，χ2检验分析IAs组和对照组之间的差异；采用ELISA法检测血清中IL-10水平，t检验分析2组之间的差异。结果IL-10基因启动子区-1082G/A位点的GG基因型和GA+AA基因型，以及G等位基因和A等位基因频率比较，IAs组较对照组GA+AA基因型以及A等位基因频率更高，差异均有统计学意义（P＜0.01），GA+AA基因型（OR值为4.137，95%CI 2.476～6.914）和A等位基因（OR值为3.368，95%CI 2.476～4.583）携带者有更高的IAs发病风险；IL-10基因启动子区-819C/T位点的CC基因型和CT+TT基因型以及C等位基因和T等位基因频率比较，IAs组较对照组CT+TT基因型以及T等位基因频率更高，差异均有统计学意义（P＜0.01），CT+TT基因型（OR值为3.393，95% CI 1.952～5.900）和T等位基因（OR值为3.764，95%CI 2.730～5.192）携带者有更高的IAs发病风险。IAs组血清IL-10水平低于对照组（P＜0.01）。结论IL-10基因启动子区SNP影响IL-10表达，IL-10基因启动子区-1082G/A、-819C/T多态性与IAs的发病有关。

颅内动脉瘤；白细胞介素10；单核苷酸多态性

颅内动脉瘤（intracranial aneurysms，IAs）是指颅内动脉管壁局部的异常扩张，其首次破裂发生蛛网膜下腔出血（SAH）后致残率和致死率均可高达33%［1］。目前认为IAs是由多种环境因素和多个基因共同作用而引发的多基因疾病［2］。炎性细胞因子相关基因单核苷酸多态性（SNP）与IAs发病的关系研究已有文献报道［3］。白细胞介素（IL）-10是体内重要的抑炎性细胞因子，本研究旨在探寻IL-10基因多态性及其血清水平

与IAs发病的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2013年5月—2015年8月在唐山市开滦总医院和河北省迁安市人民医院神经外科住院治疗的IAs患者206例（IAs组），以同期住院的187例非IAs患者作为对照组。IAs组动脉瘤破裂致SAH者143例，多发动脉瘤76例。所有IAs组患者均通过全脑血管造影（DSA）确诊为颅内囊性动脉瘤；均为散发性病例，无IAs家族史，排除动静脉畸形、马凡综合征、常染色体显性遗传性多囊肾病（ADPKD）等。对照组均经磁共振血管成像（MRA）、CT血管造影（CTA）或DSA检查排除IAs；所有研究对象均无动脉瘤及SAH家族史，无卒中病史，无遗传性结缔组织病史，彼此无亲缘关系，均为唐山地区汉族人，且均知情同意。2组临床资料比较差异均无统计学意义，见表1。

Tab.1Comparison of clinical information between two groups表1　2组临床资料比较

1.2方法

1.2.1PCR检测IL-10基因SNP位点-1082G/A、-819C/T的基因型分布采集393例研究对象的空腹肘正中静脉血5 mL，提取基因组DNA。应用美国Applied Biosystems公司生产的GeneAmp®PCR 9700型基因扩增仪进行PCR反应，由国家人类基因组北方研究中心ABI 3730XL型DNA测序仪进行DNA直接测序，并由相应软件平台发现IL-10基因启动子区SNP位点，-1082G/A和-819C/T的基因型和等位基因频率。-1082G/A引物上游5′-GATGAATACCCAAGAC TTCTCC-3′，下游5′-GATGAGTGATTTGCCCTGA-3′；-819C/T引物上游5′-GGCACTGGTGTACCCTTGTA-3′，下游5′-CATGACCCCTACCGTCTCTATTTT-3′。反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性40 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环；72℃延伸5 min。所有PCR相关试剂均由大连宝生物工程有限公司生产。

1.2.2酶联免疫吸附（ELISA）法测定血清IL-10水平静脉血离心取血清，置-20℃保存。用IL-10 ELISA试剂盒（上海瑞齐生物科技有限公司）检测人血清IL-10水平。

1.3统计学方法各位点进行Hardy-Weinberg平衡分析以检验样本是否具有群体代表性，P＞0.05则认为群体基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。用Excel软件建立数据库，并进行双遍录入，应用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料比较采用2组独立样本资料的t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1DNA测序结果检测标本均成功扩增出目的片段，-1082G/A PCR产物经测序发现3种基因型：野生纯合子GG基因型，杂合子GA基因型，突变纯合子AA基因型，见图1。-819C/T PCR产物经测序发现3种基因型：野生纯合子CC基因型，杂合子CT基因型，突变纯合子TT基因型，见图2。

Fig.1Sequencing results of genotypes in IL-10-1082G/A图1　IL-10-1082G/A基因型测序结果

Fig.2Sequencing results of genotypes in IL-10-819C/T图2　IL-10-819C/T基因型测序结果

2.2Hardy-Weinberg平衡检验结果-1082G/A IAs组（χ2=0.28，P=0.61），对照组（χ2=1.35，P= 0.26）；-819C/T IAs组（χ2=2.78，P=0.11），对照组（χ2= 0.25，P=0.55），本研究样本符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3SNP位点基因型和等位基因频率与IAs发病的关系与对照组比较，IAs组-1082G/A位点GA+AA基因型比例、A等位基因频率更高，-819C/ T位点CT+TT基因型比例、T等位基因频率更高，差异有统计学意义（P＜0.01）；且-1082G/A位点GA+ AA基因型、A等位基因以及-819C/T位点CT+TT基因型、T等位基因罹患IAs的危险性明显增高，见表2、3。

2.42组血清IL-10水平比较IAs组及对照组血清IL-10水平分别为（10.0±2.2）ng/L和（18.2±1.8）ng/L，IAs组较对照组明显降低（t=40.540，P＜0.01）。

Tab.2Polymorphism distribution of IL-10-1082G/A in IAs group and control group表2　IAs组与对照组IL-10-1082G/A位点的多态性分布例（%）

Tab.3Polymorphism distribution of IL-10-819C/T in IAs group and control group表3　IAs组与对照组IL-10-819C/T位点的多态性分布例（%）

3　讨论

IAs破裂引起的SAH是严重的脑血管事件，其后果为1/3死亡，1/3遗留严重神经功能障碍，另1/3好转［4］。而社区人群影像学筛查的IAs检出率仅为0.2%～1.8%［5］。越来越多的证据表明，免疫炎性反应与IAs的形成密切相关［6-7］。最近的病理学研究发现，IAs瘤壁组织平滑肌细胞减少或消失，纤维组织增生明显，动脉壁中膜及外膜可见有大量巨噬细胞和淋巴细胞浸润［8］。聚集的炎症细胞会分泌多种促炎性细胞因子，如IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α等，继而发挥致炎作用［9］。炎性细胞因子及其基因多态性与IAs的关系已成为研究热点。

IL-10是一种多效性的细胞因子，其能抑制Th1细胞、NK细胞等合成分泌IL-1β、TNF-α、干扰素γ等炎性细胞因子，下调细胞免疫反应，还能通过下调MHCⅡ类抗原与CD54、CD80等协同刺激分子的表达，削弱其抗原呈递能力，从而抑制炎症反应。有研究表明，IL-10基因转录起始部位上游启动子区域-1082G/A、-819C/T、-592C/A处有3个SNP位点［10］，其与IL-10基因的转录活性及血清IL-10水平有关［11］，即-1082G/A、-819C/T不同的等位基因改变了基因转录及翻译过程，-1082G、-819C、-592C与IL-10的高表达有关，而-1082A、-819T、-592A则与IL-10的低表达有关。研究表明，IL-10-819位点与-592位点等位基因紧密连锁［12］，故本研究选取-1082G/A、-819C/T为靶点。IL-10基因多态性与某些疾病的易感性有关，Vinod等［13］报道，在南印度人群中，IL-10-1082G/A位点AA基因型是乳腺癌的危险因素，相对于GA基因型，AA基因型与乳腺癌的发病有关（OR=2.854，95%CI 1.68～4.849）。

本研究结果显示，与对照组相比，IAs组-1082位点A等位基因、-819位点T等位基因频率更高，且IAs组血清IL-10水平显著降低。因此，IL-10基因启动子区-1082G/A、-819C/T位点SNP可能与唐山地区汉族人IAs的发病有关；-1082G/A位点A等位基因携带者、-819C/T位点T等位基因携带者可能增加IAs的发病风险。其可能机制为：IL-10 -1082A等位基因及-819T等位基因直接影响转录因子EtsY与该序列DNA的结合，使之不能结合EtsY从而抑制转录，IL-10基因的表达下降，因而IL-10的血清水平降低。IL-10的减少则不能抑制TNF-α等促炎性细胞因子生成，随着TNF-α水平的不断增加，导致血管内皮细胞功能障碍，引起包括巨噬细胞在内的炎性细胞渗入动脉壁参与炎性反应。巨噬细胞在IAs瘤壁破坏性重建中的具有至关重要的作用［14］，其可以释放一氧化氮，增强炎性反应，并引起平滑肌细胞凋亡，最重要的一个作用是分泌基质金属蛋白酶-9，直接导致胶原蛋白和弹性蛋白降解，分解细胞外基质，破坏动脉壁结构，在血流动力学改变等共同作用下，诱导动脉瘤的形成。反之，IL-10-1082G等位基因及-819C等位基因携带者的基因表达增加，血浆IL-10水平相对较高，炎症抑制效应明显，对血管壁有保护作用，降低了IAs的发病风险。

本研究为IAs的病因及发病机制研究提供了一个新的方向，有助于进一步地深入研究以及对高危人群进行早期基因干预，但尚需在多种族、大样本研究中得到验证。

［1］Lin N，Ho A，Charoenvimolphan N，et al.Analysis of morphological parameters to differentiate rupture status in anterior communicating artery aneurysms［J］.PLoS One，2013，8（11）：e79635.doi：10.1371/journal.pone.0079635.

［2］Ruigrok YM，Rinkel GJ，Algra A，et al.Characteristics of intracranial aneurysms in patients with familial subarachnoid hemorrhage［J］.Neurology，2004，62（6）：891-894.

［3］Sun H，Zhang D，Zhao J.The interleukin-6 gene-572G＞C promoter polymorphism is related to intracranial aneurysms in Chinese Han nationality［J］.Neurosci Lett，2008，440（1）：1-3.doi：10.1016/j.neulet.2008.04.077.

［4］Caranci F，Briganti F，Cirillo L，et al.Epidemiology and genetics of intracranial aneurysms［J］.Eur J Radiol，2013，82（10）：1598-1605.doi：10.1016/j.ejrad.2012.12.026.

［5］Connolly ES Jr.International study of unruptured intracranial aneurysms［J］.J Neurosurg，2014，121（5）：1022-1023.doi：10.3171/2013.10.JNS131485.

［6］Chalouhi N，Ali MS，Jabbour PM，et al.Biology of intracranial aneurysms：role of inflammation［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2012，32（9）：1659-1676.doi：10.1038/jcbfm.2012.84.

［7］Zhang HF，Zhao MG，Liang GB，et al.Expression of proinflammatory cytokines and the risk of intracranial aneurysm［J］. Inflammation，2013，36（6）：1195-1200.doi：10.1007/s10753-013-9655-6.

［8］Liu Z，Zhao Y，Wei F，et al.Treatment with telmisartan/rosuvastatin combination has a beneficial synergistic effect on ameliorating Th17/Treg functional imbalance in hypertensive patients with carotid atherosclerosis［J］.Atherosclerosis，2014，233（1）：291-299.doi：10.1016/j.atherosclerosis.2013.12.004.

［9］Starke RM，Raper DM，Ding D，et al.Tumor necrosis factor-α modulates cerebral aneurysm formation and rupture［J］.Transl Stroke Res，2014，5（2）：269-277.doi：10.1007/s12975-013-0287-9.

［10］Saber SE，Nagy MM，Schäfer E.Comparative evaluation of the shaping ability of ProTaper Next，iRaCe and Hyflex CM rotary NiTi files in severely curved root canals［J］.Int Endod J，2015，48（2）：131-136.doi：10.1111/iej.12291.

［11］Falconer K，Gonzalez VD，Reichard O，et al.Spontaneous HCV clearance in HCV/HIV-1 coinfection associated with normalized CD4 counts，low level of chronic immune activation and high level of T cell function［J］.J Clin Virol，2008，41（2）：160-163.

［12］Scarpelli D，Cardellini M，Andreozzi F，et al.Variants of the interleukin-10 promoter gene are associated with obesity and insulin resistance but not type 2 diabetes in caucasian italian subjects［J］.Diabetes，2006，55（5）：1529-1533.

［13］Vinod C，Jyothy A，Vijay Kumar M，et al.A common SNP of IL-10（-1082A/G）is associated with increased risk of premenopausal breast cancer in South Indian women［J］.Iran J Cancer Prev，2015，8（4）：e3434.doi：10.17795/ijcp-3434.

［14］Kanematsu Y，Kanematsu M，Kurihara C，et al.Critical roles of macrophages in the formation of intracranial aneurysm［J］.Stroke，2011，42（1）：173-178.doi：10.1161/STROKEAHA.110.590976.

（2015-12-30收稿2016-04-11修回）

（本文编辑李国琪）

The relationship between gene polymorphism and serum expression of interleukin-10 with intracranial aneurysm

SHAO Deming1，QIU Hong2，YU Xiangdong2，MA Xianghui1，LI Yunchao2，WANG Yujue2
1 Department of Neurosurgery，Qian'an People's Hospital，Qian'an 064400，China；2 Department of Neurosurgery，Kailuan General Hospital

ObjectiveTo analyze the associations of the interleukin-10（IL-10）promoter-1082G/A and-819C/T single nucleotide polymorphism（SNP）and serum level of IL-10 with intracranial aneurysm（IAs）.MethodsThe polymerase chain reaction（PCR）and DNA direct sequencing methods were used to detect IL-10 gene promoter district two SNP site，-1082G/A and-819C/T genotype frequency and allele frequency in 206 patients with IAs and 187 controls.Chisquare test was used to analyze differences between two groups.The serum level of IL-10 was analyzed by ELISA，and ttest was used to analyze significant differences between two groups.ResultsThere were significant differences in genotypes of GG and GA+AA，as well as the alleles G and A，in-1082G/A locus between IAs group and control group（P＜0.01）.There were higher frequencies of genotype GA+AA and the allele A in IAs group than those in control group（P＜0.01）.There was higher risk of suffering IAs in patients with genotype GA+AA（OR=4.137，95%CI:2.476-6.914）and the allele A（OR=3.368，95%CI:2.476-4.583）.There were higher frequencies of the genotype CT+TT and the allele T in-819C/ T locus in IAs group than those of control group（P＜0.01）.There was higher risk of suffering IAs in patients with genotype CT+TT（OR=3.393，95%CI:1.952-5.900）and the allele T（OR=3.764，95%CI:2.730-5.192）.The serum level of IL-10 was significantly lower in IAs group than that of control group（P＜0.01）.ConclusionThe IL-10 promoter SNP influences the expression of IL-10.IL-10 promoter-1082G/A and-819C/T polymorphisms are correlated with the formation of IAs.

intracranial aneurysms；interleukin-10；single nucleotide polymorphism

R651.1+2

A

10.11958/20160003

1河北省迁安市人民医院神经外科（邮编064400）；2开滦总医院神经外科

邵得明（1979），男，主治医师，硕士研究生，主要从事脑血管病的基础研究