矮冷水花成分预试验及不同溶剂提取物的抗氧化活性

曹剑锋　任朝辉　芦静波

摘要：通过对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、·OH的清除活性、还原力、螯合能力、总抗氧化能力的测定，评价矮冷水花水提取物、95%乙醇提取物及其石油醚相、乙酸乙酯相和水溶性3个不同极性部位的抗氧化活性；测定总黄酮、总酚含量；采用化学反应鉴别法对矮冷水花提取物进行化学成分预试验。预试验结果表明：矮冷水花可能含有酚类、鞣质、黄酮类、挥发油或油脂、氨基酸、多肽、蛋白质、还原糖、多糖、苷类、甾体、萜类内酯、香豆素及其苷类化学成分。试验结果表明：水提取物、95%乙醇提取物以及其石油醚相、乙酸乙酯相、水溶性部位提取物均表现出一定抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位的黄酮、总酚含量最高，分别为28.43%、2.16%，清除DPPH自由基、·OH的能力、还原力、螯合力及总抗氧化能力的IC50值分别为0.142、0.598、0.328、1.008、0.298 mg/mL，并且随着浓度的增加，清除活性增强。综合试验结果可知，矮冷水花提取物具有很好的抗氧化活性，乙酸乙酯部位抗氧化活性最强。

关键词：矮冷水花；化学成分；提取物；抗氧化活性；药用价值

中图分类号： S132 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0307-05

矮冷水花[Pilea peploides （Gaudich.）Hook.et Arn.]属荨麻科，为一年生草本，别称地油仔、苔水花。矮冷水花分布于我国华东、西南等地，常被作为蔬菜食用，因具有清热解毒、祛痰止痛、消炎、褪肿、通便、利尿等功效，民间用于清热解毒祛瘀止痛、跌打损伤、无名肿毒、毒蛇咬伤、疮疖等症[1]。陈谢生等研究矮冷水花并制成了适合防治多种毒蛇的蛇伤草药[2]；张浩等对矮冷水花进行了生药学鉴定研究[3]。有关矮冷水花的研究报道较少，本研究对矮冷水花的化学成分和对水提物、乙醇提取物不同萃取物抗氧化活性进行初步研究，以期为矮冷水花植物药用价值的开发应用提供一定参考。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

矮冷水花，采自贵阳市乌当区，经贵州师范学院朱富寿教授鉴定为荨麻科植物矮冷水花[Pilea peploides （Gaudich.）Hook.et Arn.]。

1.2 主要药品及试剂

石油醚、乙醇、乙酸乙酯、盐酸、茚三酮、三氯化铁、溴甲酚绿、乙酸、碘化汞钾、碘、碘化铋钾、硅钨酸、碱性苦味酸、3，5-二硝基苯甲酸、氢氧化钠、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水杨酸、过氧化氢、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、菲咯嗪（ferrozine）、硫酸、磷酸钠、钼酸铵、芸香苷、亚硝酸钠、硝酸铝、没食子酸、碳酸钠等，均为分析纯。

1.3 试验仪器

722分光光度计，上海精密科学仪有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；冷冻干燥机，河南兄弟仪器设备有限公司；电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；恒温水浴锅，上海梅香仪器有限公司。

1.4 不同提取物的制备

1.4.1 水提物的制备 称取100 g矮冷水花干燥粉末（全草），按料液比1 g ∶ 10 mL加入蒸馏水，浸泡24h，然后于40 ℃ 超声2 h，过滤、浓缩冻干，即得水提物，冷藏备用。

1.4.2 乙醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物及水溶性提取物的制备 称取500 g矮冷水花干燥粉末（全草），按料液比1 g ∶ 10 mL加入乙醇（95%），不时振荡，浸泡24 h；然后于40 ℃超声2h，过滤，从滤液中回收乙醇至无醇味；取1/4量浓缩液作为乙醇提取物，浓缩冻干，冷藏备用；剩余3/4浓缩液先用石油醚萃取3次，过滤，回收石油醚，浓缩冻干，即得到石油醚提取物，冷藏备用。取上述剩余的浓缩液，加入500 mL 5%盐酸，充分搅拌、过滤，将过滤部分做酸水试验。酸水不溶部分加500 mL乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯液用 500 mL 5%NaOH溶液振摇洗涤2次，弃去碱水层；乙酸乙酯层再用蒸馏水洗2次，至水洗液呈中性反应，弃去水洗液，回收乙酸乙酯，浓缩冻干，即得乙酸乙酯提取物，不溶于乙酸乙酯的部分为水溶性提取物，将其冷藏备用。

1.5 试验方法

1.5.1 化学成分预试验 （1）用石油醚提取物分别做挥发油、油脂、甾体的预试验，方法见表1。（2）用乙醇、乙酸乙酯提取物做酚类、鞣质、植物甾体、三萜类、蒽醌类、黄酮类、生物碱、香豆素与内脂、强心苷等预试验，方法见表2、表3。（3）用酸水提取物做生物碱预试验，方法见表4。（4）用水提取物做氨基酸、多肽、蛋白质、糖、多糖、苷类、鞣质、有机酸、皂苷等预试验，方法见表5。

1.5.2 黄酮含量的测定 取100 μL样品原液于试管中，加30%乙醇补齐到5 mL；然后加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀；放置6 min后，加0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀；放置6 min 后，再加入4 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液；加0.4 mL蒸馏水，摇匀，放置10～15 min后，在515 nm波长处测定上述标准溶液的吸光度[4]。

标准曲线的制作。精确配制浓度为0.1 mg/mL的对照品芸香苷的标准液，分别精确吸取0、1、2、3、4、5 mL标准液于6支具塞试管中，加30%乙醇补齐到5 mL；然后加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀；放置6 min后，加0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀；放置6 min后，再加入4 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液；加0.4 mL蒸馏水，摇匀，放置10～15 min后，在515 nm波长处测定上述标准溶液的吸光度，制作标准曲线，得到回归方程：

y=0.270 8x-0.001 5，r2=0.990 1。

式中：y为吸光度D515 nm；x为芸香苷浓度，mg/mL。

1.5.3 总酚含量的测定 取100 μL原液样品于试管中，加水补齐到0.5 mL；加入2.5 mL 0.2 mol/L Folin-Ciocalteu试剂，振荡20 s后反应5 min；再加入2 mL7.5%碳酸钠溶液，振荡20 s后反应1 h，于760 nm测定吸光度D760 nm[5]。

标准曲线的制作。配制浓度为100 μg/mL的没食子酸溶液，分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，共6支试管，加水补齐到0.5 mL；加入2.5 mL 0.2 mol/L Folin-Ciocalteu试剂，振荡20 s后反应5 min；再加入2 mL7.5%碳酸钠溶液，振荡20 s后反应1 h，在760 nm处测定吸光度D760 nm。空白对照用蒸馏水代替样品，制作标准曲线，得到回归方程：

y=34.799x+0.002 2，r2=0.999 1。

式中：y为吸收光度D760 nm；x为没食子酸浓度，mg/mL。

1.5.4 不同部位的抗氧化活性测定 （1）DPPH·清除活性。以95%乙醇为溶剂，配制浓度0.2 mmol/L的DPPH·溶液。加样品后于试管中补齐至1 mL，加入1 mL DPPH溶液，使总体积为2 mL，摇匀。室温放置30 min后记录517 nm处吸光度D517 nm（样品）[6-7]；向1 mL DPPH·溶液中加入1 mL蒸馏水，记录吸光度D517 nm（空白），即为空白对照；以维生素C为阳性对照。根据以下公式计算样品DPPH·清除率：

DPPH·清除率=（D517 nm（空白）-D517 nm（样品））/D517 nm（空白）×100%。

（2）·OH清除活性。分别在试管中加入1 mL 3 mmol/L硫酸亚铁溶液、1 mL 3 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、1 mL 005%过氧化氢溶液，立即混匀，然后加入不同体积的样品溶液并补齐至1 mL。以等体积的蒸馏水作为空白对照，于 37 ℃ 反应30 min，在510 nm下测量吸光度D510 nm（样品）、D510 nm（空白）[8]。以1 mL 3 mmol/L硫酸亚铁溶液、1 mL 3 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、2 mL蒸馏水作为本底吸收（调零管）。相应公式为：

清除率=（D510 nm（空白）-D510 nm（样品））/D510 nm（空白）×100%。

（3）还原力测定。加入不同体积的样品后补齐至1 mL，再加入2.5 mL 0.2 mol/L、pH值为6.6的磷酸盐缓冲液和25 mL 1%铁氰化钾溶液，于50 ℃水浴20 min；加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min离心10 min；取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水、0.5 mL三氯化铁（0.1%），于700 nm 处测定吸光度D700 nm[9-10]，以维生素C为阳性对照。

（4）螯合能力测定。加入不同体积的样品后补齐至 1 mL，再加入3.7 mL蒸馏水、0.1 mL 2 mmol/L氯化亚铁（FeCl2）溶液，振荡30 s，混合均匀；然后加入0.2 mL 0.5 mmol/L ferrozine启动反应，室温放置30 min；接下来于3 000 r/min 离心 5 min，取上清液在562 nm处测定吸光度D562 nm，以EDTA为对照[11]。

（5）总抗氧化能力的测定。加入不同体积的样品后补齐至1、4 mL，试剂中含0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸钠、4 mmol/L钼酸铵，混匀后于95 ℃水浴中恒温90 min，在695 nm 波长下测其吸光度D695 nm。空白用1 mL蒸馏水代替样品液，以维生素C作为阳性对照[12]。

1.5.5 数据统计 数据以均值±标准差（x±s）表示，采用SPSS 11.5软件进行t检测处理 。

2 结果与分析

2.1 化学成分预试验结果

石油醚提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、酸水提取物、水提取物化学鉴别试验结果分别见表1至表5。

2.2 矮冷水花不同提取物黄酮、酚类含量

由表6可以看出：矮冷水花乙酸乙酯提取物的总黄酮含量最高，为28.43%；其次是乙醇提取物中的含量，为2176%；水溶性、水提取物中黄酮含量分别为1.83%、192%。因此，矮冷水花黄酮主要集中在乙酸乙酯、乙醇部分，矮冷水花乙酸乙酯提取物的总酚含量为2.16%，含量最高；乙醇提取物、水溶性、水提取物总酚含量分别为077%，0.59%、0.27%，因此可知，矮冷水花总酚含量主要集中在乙酸乙酯部分，其次是乙醇部分。

2.3 DPPH· 清除活性

从图1可以看出，矮冷水花不同提取物对DPPH·均具有一定的清除作用，且随着提取物浓度的增加，清除能力逐渐增强；在浓度为0.5 mg/mL时，乙酸乙酯提取物对DPPH·清除活性可达到97.0%，高于同浓度乙醇提取物的76.2%、水溶性部分的53.7%，以及水提物的7.4%。因此可知，矮冷水花乙酸乙酯提取物对DPPH·清除活性最强。

2.4 ·OH清除活性

从图2可以看出，矮冷水花不同提取物对·OH均具有一定的清除作用，且随着提取物浓度的增加，清除活性逐渐增强。在浓度为1.5 mg/mL时，乙酸乙酯提取物对·OH清除活性可达到99.9%，同浓度的水提物、乙醇提取物、水溶性部分的清除率分别为94.8%、73.2%、67.7%。因此矮冷水花乙酸乙酯提取物对·OH自由基清除活性最强，其次为水提取物部位。

2.5 还原力测定

从图3可以看出，矮冷水花不同提取物均具有一定的还原能力，且随着提取物浓度的增加，还原能力逐渐增强。在浓度为1 mg/mL时，乙酸乙酯提取物还原能力D700 nm为1.31，同浓度的乙醇提取物、水溶性部分、水提物D700 nm分别为0.78、0.39、0.19。因此，矮冷水花乙酸乙酯提取物的还原能力最强。

2.6 螯合能力测定

从图4可以看出，矮冷水花不同提取物均具有一定的螯合能力，且随着提取物浓度的增加，螯合能力逐渐增强。在浓度为1.2 mg/mL时，水提取物螯合能力D562 nm为0.87，同浓度的乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、水溶性部分的D562 nm分别为0.53、0.52、0.16。因此可知：矮冷水花水提取物的螯合能力最强，乙酸乙酯提取物次之。

2.7 总抗氧化能力的测定

从图5可以看出，矮冷水花不同提取物均具有一定的总抗氧化能力，且随着提取物浓度的增加，总抗氧化能力逐渐增强。在浓度为1.2 mg/mL时，乙酸乙酯提取物总抗氧化能力D695 nm为1.35，高于同浓度的乙醇提取物的0.52；水溶性提取物的D695 nm为0.13，明显高于水提物的0.01。因此可知，矮冷水花水提取物的总抗氧化能力最强，主要集中在乙酸乙酯、乙醇提取物部位。

2.8 矮冷水花不同提取物抗氧化IC50值

由表7可见，在4个不同提取物中，清除DPPH·能力、还原力、总抗氧化能力大小依次是：乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性>水提物，其中乙酸乙酯提取物清除DPPH·的活性约为维生素C的1/10，乙醇提取物约为维生素C的1/20左右； 清除·OH自由基活性能力大小依次是：乙酸乙酯提取物>水提物>乙醇提取物>水溶性，水提物表现较强的清除·OH活性，其活性约为纯品维生素C的1/6；螯合能力大小依次是：水提物>乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性。3 结论

预试验结果初步表明：矮冷水花中可能含有黄酮类、酚类、香豆素类、挥发油、植物甾醇、糖类、苷类、鞣质、有机酸等化学成分。本研究初步确定了矮冷水花可能存在的化学成分， 为矮冷水花活性成分的提取、分离、纯化和筛选研究提供了科学依据。

本研究表明，植物提取物的抗氧化活性与植物中多酚、黄酮含量密切相关[13-16]。通过对比冷水花抗氧化活性与总黄酮、总酚含量可知，矮冷水花提取物不同极性部位黄酮、总酚含量大小依次为：乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性>水提物。体外抗氧化研究结果表明：4种提取物对DPPH·清除力、还原力、螯合力、总抗氧化力均表现出一定的抗氧化能力，次序是：乙酸乙酯提取物>乙醇提取物>水溶性>水提物，对DPPH·表现出中等极性乙酸乙酯的活性较强，极性大的水部位相对较弱，但对羟自由基清除能力方面，水提取物明显较强。总之，本试验结果表明，乙酸乙酯提取物部位是矮冷水花抗氧化活性的主要部位，提示黄酮、多酚类化合物是矮冷水花抗氧化作用的主要物质基础。

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