金莲花种子无菌播种及离体培养技术

胡海英　李瑜

摘要：通过金莲花种子无菌播种、离体培养技术的研究，初步建立金莲花离体培养的技术体系和方法，为其种质资源的保护和利用提供前期的技术基础。以金莲花种子为外植体，筛选出适宜金莲花无菌播种发芽、离体培养的培养基配方。结果表明：金莲花种子用100 mg/L GA3冷浸4 d效果最佳，其发芽率为92.67%；用无毒级杀菌消毒剂爱力克配制成 2 500 mg/L，与75%乙醇配合消毒20 min效果最佳；适宜金莲花种子无菌播种培养基配方为MS+0.1 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA；适宜金莲花试管苗丛生芽增殖的培养基配方为1/2MS+ 0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L KT+05 mg/L IBA+100 mg/L PVP+40 mg/L维生素C；适宜金莲花试管苗壮苗生长的培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA +40 mg/L 维生素C+100 mg/L PVP+0.5%活性炭。

关键词：金莲花；种子；无菌播种；组织培养

中图分类号： S567.23+9.043 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0230-03

金莲花（Trollius chinensis Bunge.）别称旱荷、旱莲花、寒荷、陆地莲等，为毛茛科金莲花属，属于一年生或多年生草本植物，喜冷凉湿润环境，多生长在海拔1 800 m以上的高山草甸或疏林地带。金莲花在我国分布较为广泛，其主产地在河北塞罕坝上周边地区的沿坝地带，在宁夏主要零星分布于六盘山等地区。金莲花植株秀丽、花色金黄，是优良的花坛、花镜和盆花材料[1-3]；同时，金银花花朵有极高的药用价值，可入药或制茶[2-6]。目前，国内有关金莲花的研究多集中于金莲花药理成分提取、分离、鉴定和医药制剂与质量控制方面[7]，如刘丽娟等对长瓣金莲花[8]、黄文哲等对短瓣金莲花[9]的茎叶化学成分进行了研究，叶绍明等通过研究建立了关于金莲花有效成分的提取工艺体系[10]。在金莲花的人工栽培、养护管理方面，陈智卿等进行了一系列较为详尽的研究，认为通过实生播种进行金莲花种苗培育，其幼苗死亡率高达70%～80%，且幼苗期栽培管理较难，难以达到迅速培育优质种苗的目的[1-2，11]；由于金莲花的休眠特性，使其自然繁殖系数低，幼苗死亡率高。在金莲花组织培养的研究方面，国内有零星相关报道，杨玉芳等以山西金莲花种子为材料建立了金莲花离体培养体系，但是金莲花除菌环节较困难，污染严重，繁殖系数低[12]。因此，解决金莲花发育迟缓、无菌苗生长缓慢、继代不稳定等问题仍是当前重要的研究工作。本研究在药用植物组织培养研究的基础上，通过不同种类、不同浓度细胞分裂素、生长素的搭配使用，选择适宜的种子无菌播种、增殖培养的培养基配方，初步建立金莲花离体培养技术和方法，以期为金莲花种质资源保护与利用提供前期的试验支持。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

金莲花种子，由宁夏隆德县金莲花示范种植基地提供，引种于河北坝上地区，别称坝上金莲花。经干燥、挑拣杂物等处理后，置于牛皮纸袋中，于4 ℃冰箱冷藏保存。

在无菌播种前解除种子休眠，先将种子清洗后浸没于100 mg/L GA3溶液中，于4 ℃低温冷藏4 d（该条件发芽率可达92.67%）后进行无菌消毒。培养基采用MS基本培养基[13-15]，其中含6 g/L琼脂、30 g/L蔗糖，pH值5.8。添加的植物激素有细胞分裂素6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、噻苯隆（TDZ）；生长素α-萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IBA）。抗氧化剂为聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、维生素C。吸附剂为活性炭。

消毒液选用上海宇涵生物科技公司生产的新一代无毒级杀菌消毒剂爱立克，配制成2 500 mg/L浓度备用。

1.2 试验方法

1.2.1 不同消毒时间对金莲花种子无菌萌发的影响 将清洗并解除休眠的种子置于超净工作台上，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用无菌水清洗3次，再用2 500 mg/L消毒液分别浸泡15、20、25 min，最后用无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干水分后接种到培养基中，观察种子的发芽情况、污染情况，统计其发芽率、污染率。培养条件：光照时间8 h/d，光照度为 1 000 lx，培养温度为（25±1） ℃。

1.2.2 金莲花种子无菌接种培养基的筛选 用以上筛选出的打破休眠并用最佳无菌消毒方法处理的种子后，将种子接种在不同配方的培养基上。以污染率、发芽率为指标，筛选种子无菌播种最适培养基配方。培养条件：光照时间8 h/d，光照度1 000 lx，培养温度（25±1） ℃。

1.2.3 金莲花试管苗丛生芽增殖培养基的筛选 将金莲花试管苗分成带部分根、茎、叶的材料，分别接种到含不同浓度6-BA、TDZ、IBA的增殖培养基中（配方详见表2），观察其从生芽的分化情况。培养条件：光照时间8 h/d，光照度 2 000 lx，培养温度（25±1） ℃。

1.2.4 金莲花试管苗壮苗生根培养基的筛选 以金莲花试管苗为材料，分别接种到含不同浓度的TDZ、NAA、IBA的壮苗生根培养基中（培养基配方见表3），观察其生长及生根情况。培养条件：光照时间8 h/d，光照度2 000 lx，培养温度（25±1） ℃。

1.3 数据统计

本研究中用到的相关公式如下：发芽率=（发芽的种子数/试验种子总数）×100%；污染率=（污染的种子数/试验种子总数）×100%；成苗率=（发芽种子形成幼苗数/发芽的种子数）×100%；增殖系数= （再生丛生芽数/接种数）×100%。

统计分析所得数据采用SPSS 19.0软件进行标准误及方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对种子无菌萌发的影响

经种子休眠解除处理后，对金莲花种子进行无菌消毒处理，由表4可以看出，灭菌时间不同，消毒效果不同，即污染率不同。

消毒时间为15 min，接种3～7 d后，种子表面长出霉菌，颜色为白色、黑色居多且菌毛较长，形成较大的菌圈，培养基表面形成1层墨绿色的菌层，种子材料全部被污染，无发芽。延长灭菌时间至20 min，污染率为21.47%，发芽率可达50%。灭菌时间延长至25 min时，接种3～7 d后，部分培养基会轻微泛黄，发芽率低。结果说明，灭菌时间过长则会抵制种子活性，影响种子发芽，因此选用2 500 mg/L消毒剂爱立克结合75%乙醇对金莲花种子灭菌处理20 min，可以达到较好的消毒效果。

2.2 不同激素配比对金莲花种子无菌发芽效果的影响

不同种类、浓度配比的细胞分裂素、生长素可以直接影响金莲花种子的无菌发芽效果。从表5可以看出，选用含 0.05～0.10 mg/L TDZ培养基进行金莲花无菌播种，与含有NAA、6-BA植物激素的培养基相比，种子的发芽率、成苗率相对较高，而且发芽时间也较其他培养基快4～8 d。从发芽率、成苗率、发芽时间的比较可知，选用培养基MS+0.1 mg/L TDZ +0.5 mg/L IBA进行无菌播种，其种子发芽率为51%，成苗率达50%，较其他培养基效果明显。由此可知，MS+0.1 mg/L TDZ +0.5 mg/L IBA培养基适合用于金莲花种子的无菌发芽培养（图1）。

2.3 不同激素配比对金莲花试管苗丛生芽增殖的影响

从表6可以看出，增殖培养20 d后，各培养基金莲花从生芽的增殖系数有明显差异。经方差分析可知，金莲花在B6增殖培养基中增殖系数显著高于其他培养基，接种后长出新生芽的时间较短，约为21 d，且增殖丛生芽数多、生长健壮。在本研究中，光照培养一段时间后，材料容易褐化。有研究报道，褐变在植物组织培养中普遍存在，不同植物可采用不同的方法进行预防和控制[14]。笔者发现，在培养基中加入PVP、活性炭可有效防止褐变的发生。

2.4 不同激素配比对金莲花试管苗壮苗生根培养的影响

不同激素配比对金莲花试管苗生长影响不一，在添加不同生长素的培养基中诱导获得的不定根粗而短，且叶片边缘伸展程度大。由于试验中添加了活性炭，叶片、茎部没有褐化现象，且明显促进了生根。未添加生长素的培养基中诱导获得的不定根数量少、植株矮小、生长缓慢，说明生长素，尤其是NAA有利于金莲花不定根的形成，从而促进试管苗的伸长生长。因此，选用C2（1/2MS+0.5 mg/L NAA+40 mg/L维生素C+100 mg/L PVP+0.5%活性炭）培养基作为金莲花试管苗壮苗生根培养基（表7）。金莲花试管苗增殖培养效果见图2。

3 结论

由本研究结果可知，（1）4 ℃低温层积结合100 mg/L GA3可以有效打破金莲花种子的休眠，低温层积处理4 d效果最佳，种子发芽率可达92.67%。（2）用新一代无毒级杀菌消毒剂爱力克，配制成2 500 mg/L溶液，与75%乙醇配合消毒20min效果最好。（3）细胞分裂素、生长素不同浓度配比影响金莲花的无菌发芽、增殖生长，适宜金莲花无菌发芽的培养基为MS+0.1 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA；适宜金莲花试管苗丛生芽增殖的培养基为1/2MS+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L IBA+100 mg/L PVP+40 mg/L 维生素C；适宜金莲花试管苗壮苗、生根的培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA+40 mg/L维生素C +100 mg/L PVP+0.5%活性炭。（4）在培养基中加入维生素C、PVP等抗氧化成分，配合活性炭，并在金莲花无菌试管苗再生出2～3张叶、培养时间约为18 d时及时对其幼苗进行转接，可有效避免褐化。

4 讨论

4.1 金莲花种子休眠的解除方法

顾增辉等研究认为，纯丙酮配制GA3溶液浸泡种子 4 h 处理金莲花种子发芽效果最好[4]，与本研究结果一致。但处理后，将种子进行无菌消毒后进行播种时，种子在培养基中的发芽效果与纸床发芽效果差异显著。可能是因为用纯丙酮对种子处理过后，虽然对种子经过几次无菌水的清洗，但不排除还留有一定量纯丙酮溶液对种子萌发造成的影响，使长出的幼苗不能顺利生长成苗。因此，是否用此方法对金莲花种子进行休眠解除并应用于组织培养还有待于进一步研究。

4.2 不同的无菌消毒方法

在野生花卉引种驯化中，以种子为外植体建立离体培养体系是一条多快好省的途径，但在建立离体培养技术前的基础是对外植体进行无菌消毒。在对金莲花无菌消毒方法中，杨玉芳等采用HgCl2消毒，对种子有一定的毒害作用，造成材料大量污染、发芽率低等问题[12]。在本试验中，用新型的消毒剂对种子组织毒害小，除能杀死所有细菌繁殖体外，对所有细菌芽孢、病毒、藻类和真菌等均有很强的杀灭作用，但是长时间作用也会对种子产生毒害，从而影响种子萌发。并且外植体污染问题不能根除，也可能与金莲花本身的野生生存环境有关，金莲花快速生长期、种子成熟期为多雨季节，多湿、半阴环境有利于微生物的繁衍，其果实为蒴果，采收时蒴果均已开裂，其间繁衍了大量真菌或细菌等微生物，增加了组织培养材料除菌的难度[15-16]。

4.3 金莲花试管苗发芽、生长缓慢

本研究发现，金莲花种子的发芽率在有菌环境（培养皿滤纸发芽）、无菌培养基条件下存在一定的差异。前者种子发芽率略高于后者，且发芽时间短（3 d开始发芽），严力群等也有过类似报道[5]。但在无菌培养基中，最快6 d开始发芽，可能是无菌培养基含水量高、各种激素配合作用，以及pH值等均是影响金莲花种子发芽慢的因素，但主导制约因素还待研究。另外，本研究中使用具有细胞分裂素作用的TDZ，能诱导离体培养材料的多种途径形态发生，比6-BA、KT等细胞分裂素效果明显。在培养基中加入维生素C、PVP，配合活性炭，并在金莲花无菌试管苗再生出2～3张叶时（培养时间约为18 d左右），及时对其幼苗进行转接，可有效避免褐化。尽管综合应用了以上措施，但金莲花无菌发芽最快在第6天，且增殖系数最多为1.75，还不能完全达到离体快繁的目标。因此，解决金莲花试管苗生长缓慢、提高增殖快繁倍数仍是今后的研究重点。

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