小蓬竹根际土壤可培养细菌多样性

李鹏　刘济明　文爱华

摘要：以罗甸县小蓬竹根际土壤为研究对象，采用稀释平板法调查土壤微生物数量，并挑选菌落形态存在差异的细菌菌株，对其16S rDNA序列进行分析，构建系统发育树，研究根际土壤可培养细菌多样性，为小蓬竹的保护以及喀斯特山地土壤微生物多样性研究提供一定的理论依据和技术支撑。结果表明：小蓬竹根际土壤微生物数量由多到少为细菌>放线菌>真菌，干土中所含细菌、真菌、放线菌的平均数量分别为8.32×107、9.19×105、2.32×106 CFU/g。分离纯化共获得菌落表型差异的细菌41株，16S rDNA有效序列进行Blast比对，可划分为26个分类单元，Shannon-Wiener多样性指数H为1.067 9，丰富度指数S为7，均匀度指数J为0.548 8，优势度指数D为0.521 7。基于细菌16S rDNA序列建立系统发育树，结果表明：30株细菌属于厚壁菌门（Firmicutes）（按单元种类数计算所占比例为73.17%），10株属于变形菌门（Proteobacteria）（24.39%），1株属于拟杆菌门（Bacteroidetes）（2.44%），其中芽孢杆菌属（Bacillus）占绝对优势。由结果可知，小蓬竹根际土壤中含有较为丰富的微生物多样性。

关键词：小蓬竹；根际土壤；可培养细菌；微生物多样性

中图分类号： S154.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0223-04

根际微生物是指存在于植物根系微区域直接影响土壤的结构、生物化学活性及土壤养分利用效率[1]的微生物类群，主要包括细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等。根际土壤微生物具有数量庞大、种群结构复杂、代谢旺盛、繁殖速度快等特点，推动土壤物质与能量的流动，将土壤微生物种群、数量以及分布作为评价土壤生态环境质量的重要指标。根际微生物的研究越来越受到学者的重视[2-3]，国内有关茶树[4]（Camellia sinensis）、烤烟[5]（Nicotiana tabacum）、槟榔[6]（Semen arecae）、野生稻[7]（Oryza rufipogon）根际微生物的研究较多。但是对喀斯特地区土壤微生物种群多样性的研究相对较少，针对于小蓬竹根际土壤微生物种群多样性的研究更是一片空白。

小蓬竹[Drepanostachyum luodianense （Yi et R. S. Wang） Keng f.]对于喀斯特环境具有很好的生境适应性以及较强的抗逆性，在裸露的喀斯特石山甚至悬崖上均有广泛分布[8]。丛生的小蓬竹的枝叶可较好地覆盖裸露的岩层，提高喀斯特地区植被的覆盖率，其地下部分可以减少水土流失、改良土壤理化性质，进而提高土壤活力。在石漠化治理中关于石漠化地区植被恢复物种的选择上，小蓬竹完全可以作为一个很好的候选物种。因此，开展小蓬竹根际微生物研究，掌握小蓬竹根际土可培养微生物数量及种群结构，对于小蓬竹的保护、丰富喀斯特地区土壤和竹类微生物资源，都具有很好的理论及现实意义。

本研究采用稀释平板法统计小蓬竹土壤微生物数量，分离纯化其根际土壤中的细菌，并基于16S rDNA序列特征对分离的菌株进行系统发育分析，初步获得小蓬竹根际细菌的物种多样性信息，以期为进一步开展小蓬竹对恶劣的喀斯特生境适应性与微生物关系研究和喀斯特地区微生物资源的开发利用提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 土样的采集与处理

于2014年5月上旬，选择小蓬竹主产区罗甸，该区域为典型的喀斯特丘陵地貌，小蓬竹群落分布较为典型。试验地位于坡下位，地理位置为106°45′17″E、25°30′39″N，平均海拔757 m，土壤为典型的喀斯特石灰土，土壤肥力较高，pH值为7.68。沿等高线分别设置5个样地（5 m×5 m），在各样方随机选10株竹，沿着竹基部挖取健康根系，采集土壤的深度为 5～20 cm，连同根系一起装入无菌袋中并注明采集地点、日期、土样号（轻轻抖动1 min，取附着根系2 mm左右的土壤为根际土）[9]。试验所用小蓬竹根际土壤为5个样地采集的等量混合土壤样品，土样冰箱低温保存（4 ℃），以进行微生物的分离和计数（1周内分离）。

1.2 根际微生物的分离计数

（1）细菌分离和培养采用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15～25 g，加水补足至1 000 mL，pH值7.4～7.6。（2）真菌分离培养采用马丁氏-孟加拉红培养基：KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖10 g，1/3 000孟加拉红（Rose Bengal）100 mL，琼脂15～20 g，加水补足至1 000 mL，pH值自然。培养基也可以加入青霉素，加入量为100 U/mL，同时加入庆大霉素 160 U/mL，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰性。（3）放线菌培养采用改良高氏1号培养基：可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20 g，pH值7.4～7.6 （每300 mL培养基中加3%重铬酸钾1 mL）。

牛肉膏蛋白胨培养基、孟加拉红培养基、PDA培养基和改良的高氏1号培养基于121 ℃灭菌20 min，土壤微生物的分离计数每种培养基倒6皿，纯化时每种培养基倒3皿，凝固成平板备用。

采用稀释平板涂抹法，在无菌培养皿中倒入15～20 mL选择性培养基，待凝固后，用无菌移液枪吸取0.1 mL各稀释度的土壤悬液，不同浓度稀释度的土壤悬液在牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基和孟加拉红琼脂培养基平板上进行涂布培养。细菌于37 ℃培养2～4 d，放线菌于28 ℃培养 7 d，真菌于28 ℃培养5 d，然后进行分离、计数（细菌和放线菌的最佳计数的菌落形成单位在30～300个之间，真菌的菌落形成单位在10～100个之间）。

1.3 细菌16S rDNA的扩增

采取购买的生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取分离纯化的细菌基因组DNA，提取之后的DNA选用细菌通用引物（正向引物27 F；反向引物1495 R）对细菌、放线菌的16S rDNA扩增，然后采用1.2%琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴化乙锭）电泳检测。

选用细菌通用引物[10]（正向：27 F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向：1 495 R，5′-CTACGGCTACCTTGTTALGA-3′），采用适宜的反应条件，对16S rDNA进行PCR扩增。正向引物27F、反向引物1 495R分别位于大肠埃希氏菌（Escherichia coli）16S rDNA序列的8～27位和1 495～1 514 位的碱基位置上。

细菌采用50 μL的PCR反应体系：Taq PCR Master Mix 25 μL；基因组DNA模板1 μL；正向引物27F 2 μL；反向引物1495R 2 μL；Nuclease-free ddH2O 20 μL。扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 3 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。用1.2%琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴化乙锭）电泳进行检测。

1.4 16S rDNA序列分析

PCR扩增产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司 （Invitrogen） 测序，测序后登陆GenBank对比，利用GenBank通过BLAST对测序结果进行比对分析，下载最相近菌株的16S rDNA序列，用Clustal X[11]按照最大同源性的原则进行排序，采用Kimura 2（Kimura，1980）计算核苷酸差异值[12]，再采用Neighbor-Joining[13]构建系统进化树，自展数（bootstrap）为 1 000。

1.5 细菌种群的多样性分析

定义16S rDNA、ITS rDNA序列同源性>97%作为同一分类单元[14]，采用Shannom-Wiener指数（H）、均匀度（Pielou）指数（J）、丰富度指数（S）和Simpson优势度指数（D），分析小蓬竹根际土壤环境的微生物多样性特征。

多样性Shannom-Wiener指数：

H=-∑Si=1PilnPi。

式中：Pi为第i种的多度比例，可表示为Pi=Ni/N，Ni为属i的单菌落数量，N为根际土样的所有菌株数之和。

Pielou指数：

J=-∑Si=1PilnPi/lnS。

式中：S为分类单元，可表示为属（种）i所在根际土壤中属（种）的数目。

根际土壤中不同物种所起的作用及所占的地位，选用Simpson优势度指数表示，公式如下：

D=∑P2i。

2 结果与分析

2.1 小蓬竹根际土壤微生物数量分析

由表1可知，干土中微生物数量由多到少为细菌>放线菌>真菌，细菌在根际土壤中占绝对优势，占根际土壤微生物总数的96.25%。小蓬竹根际土壤中，干土中约含有细菌832×107 CFU/g，与张友杰等对烤烟不同生育期根际土壤微生物含量变化的研究（3.73×107个/g干土）结果[15]在同一数量级；约含放线菌2.32×106 CFU/g，比雍太文等对不同种植模式下小麦土壤根际微生物数量研究结果（2.3×105～3.8×105个/g 干土）结果[16]高1个数量级；约含真菌9.19×105 CFU/g，与殷瑶等对不同年龄麻疯树林土壤放线菌、真菌（14.68×104～22.46×104 CFU/g）的研究结果[17]在同一数量级。

2.2 小蓬竹根际土壤细菌种群多样性分析

利用牛肉膏蛋白胨培养基对小蓬竹根际土壤的41株细菌分离培养物的16S rDNA进行测定，共获得41条有效序列。登陆GenBank，进行相似性对比表明，它们分属于7属26种。小蓬竹根际土壤细菌Shannon-Wiener多样性指数H为1067 9，丰富度指数S为7，均匀度指数J为0.548 8，及优势度指数D为0.521 7。土壤细菌菌株与数据库中已知细菌的16S rDNA具有较高的相似度，从97%到99%不等（表2）。

细菌16S rDNA序列的系统发育树结果（图1）显示，所得41条有效序列主要分属3大类群。其中30株细菌属于厚壁菌门（Firmicutes）（按单元种类数计算所占比例为73.17%），10株属于变形菌门（Proteobacteria）（24.39%），1株属于拟杆菌门（Bacteroidetes）（2.44%）。

厚壁菌门在小蓬竹根际细菌种类中所占比例较高，成为根际可培养细菌的最优势类群。该类群29株细菌（68.4%）均与芽孢杆菌属（Bacillus）关系密切，细菌16S rDNA序列除B-107与Bacillus sp. CL1.8（AM934693.1）的相似度为97%外，其余均为99%，相似度极高；仅1株与动物球菌属（Planococcus）关系密切，16S rDNA序列相似度为98%。

变形菌门为分离得到的第二大优势类群，其中5株与溶杆菌属（Lysobacter spp.）关系密切，细菌16S rDNA序列相似度为99%；2株与假单胞菌属（Pseudomonas）关系密切，16S rDNA序列相似度为99%；2株与贪铜菌属（Cupriavidus）密切相关，16S rDNA序列相似度为99%；反1株与鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）关系密切，16S rDNA序列相似度为98%。

1株拟杆菌门（Bacteroidetes）的细菌（B-12）与金黄杆菌属（Chryseobacterium）关系密切，16S rDNA序列相似度为99%。

3 讨论

3.1 小蓬竹根际土壤微生物数量

小蓬竹根际土壤干土中所含微生物总数为8.64×107 CFU/g，总体上小蓬竹根际土壤中微生物总数较多，细菌数量占优势，防线菌次之、真菌数量较少。花棒微生物总数及细菌、真菌、放线菌数量均高于小蓬竹根际土壤微生物数量[18]。灰木莲人工林地土壤微生物春、秋、冬季2种林地都是细菌>放线菌>真菌[19]。华菊玲等对连作芝麻根际土壤微生物群落的研究表明，新生、连作2、5年芝麻地微生物数量与本研究的微生物细菌、真菌、放线菌数量都在同一数量级[20]。

3.2 小蓬竹根际土壤细菌多样性

小蓬竹根际土壤细菌主要分为三大类，分别为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门。李潞滨等研究发现，毛竹、冷箭竹共有细菌类群厚壁菌门、变形菌门[21]，其中在毛竹的厚壁菌门方面，本研究结果与之较为相似。小蓬竹细菌类群的芽孢杆菌属占绝对优势，与竹林根际可培养微生物种群多样性分析结果[22]一致。虽然小蓬竹与冷箭竹（Bashania fangiana）[23]、毛竹（phyllostahys pubescens）[21]根际土壤微生物种类之间存在一定的相似性，但具有其自身特有的菌群结构。

本研究仅采用牛肉膏蛋白胨单一培养基分别对小蓬竹根际土壤细菌进行分离研究，初步揭示了小蓬竹根际土壤特有生境中微生物种群的组成特征，但仍然存在一定的局限性。应采用多种有效的培养基对土壤样品进行更为全面的分离培养，将充分了解小蓬竹根际可培养微生物细菌种群的完整信息。此外，由于自然环境中大部分微生物不能通过常规方法进行培养，应用传统的微生物分离培养方法研究土壤微生物区系将导致微生物多样性严重丢失[24]。对于小蓬竹根际土壤未培养或不能培养的微生物，非常有必要采用不依赖纯培养的分子生物学方法，以获取更全面的小蓬竹根际微生物多样性信息。

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